荧光定量pcr罗氏480使用步骤

罗氏LightCycler® 480 实时荧光定量PCR系统是实验室中常用的一款中高通量qPCR平台。以下是其标准的使用步骤流程，适用于绝大多数使用SYBR Green或TaqMan探针进行核酸扩增和定量分析的场景：

罗氏LightCycler® 480 使用步骤

一、实验准备

1. 核酸提取

• 提取DNA或RNA（如为RNA需进行反转录获得cDNA）

• 评估浓度与纯度（建议A260/A280介于1.8–2.0）

2. 试剂准备

• 根据实验方案选择合适的qPCR试剂（如SYBR Green I Master、Probe Master）

• 准备引物/探针工作液，确保无气泡、低温避光保存

二、反应体系配置

标准反应体系（以20 µL体积为例）：

注意：

• 所有反应成分应在冰上配置；

• 引物浓度通常在0.2–0.5 µM之间；

• 若使用多重qPCR，请确保荧光通道互不干扰。

三、装板与封板

1. 将反应混合液分装至96孔或384孔反应板中；

2. 使用专用光学封板膜密封反应板；

3. 轻压封膜并离心去除气泡（例如2000 rpm × 30秒）；

4. 插入LightCycler® 480中指定托架位置。

四、程序设定（软件操作）

在LightCycler® 480 Software中设置PCR程序，以下为常用的SYBR Green法设定模板：

1. 预变性：95°C, 10 min

2. 循环阶段（40–45 cycles）：

• 变性：95°C, 10 sec

• 退火：60°C, 20 sec（具体温度依引物而定）

• 延伸：72°C, 20 sec（有时与退火合并）

3. 熔解曲线分析（如用SYBR Green）：

• 95°C, 5 sec

• 65°C–95°C逐步升温，每步0.5°C，采集荧光

4. 荧光采集通道：根据染料选择通道（如FAM通道用于SYBR或FAM-TaqMan探针）

五、运行与监控

1. 确认热盖温度（一般为105°C）；

2. 启动程序运行，期间可实时观察扩增曲线；

3. 运行时间约为1.5–2小时（视程序设定而定）；

六、数据分析

1. 扩增曲线查看：确认每孔反应特征，是否存在拖尾、背景信号；

2. Ct值判读：导出或自动生成Ct结果表；

3. 熔解曲线分析（SYBR Green）：判断特异性与是否出现非特异扩增；

4. 标准曲线法（如绝对定量）：生成曲线并计算拷贝数；

5. 表达量分析（如相对定量）：使用ΔΔCt法比较表达差异；

七、数据导出与保存

• 可导出 .xls, .pdf, .xml 等格式结果；

• 保存完整项目用于追溯和后续分析；

• 建议同时备份至本地和实验室服务器。

八、仪器清洁与维护

• 每次使用后清理反应板托盘；

• 定期进行光路校准与温控验证；

• 每月检查热盖压力与荧光通道响应；

• 若长期不使用，建议进行关机保护处理。