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赛默飞实时荧光定量PCR的工作流程

发布时间:2024/11/25点击次数:87

赛默飞实时荧光定量PCR仪的工作流程

赛默飞实时荧光定量PCR仪(如ViiA™ 7、7500、QuantStudio系列)以其高精度和多功能性广泛应用于分子生物学实验。要实现高效、准确的实验结果,遵循标准化的工作流程至关重要。以下是赛默飞实时荧光定量PCR仪的详细工作流程,从样品准备到数据分析的每个环节均作了详尽说明。


1. 实验准备阶段

(1) 样品准备

  1. 核酸提取

    • 从细胞、组织或其他样品中提取目标DNA或RNA模板。

    • 如果是RNA样本,需使用逆转录酶将RNA转录为cDNA。

    • 确保核酸的纯度和浓度符合实验要求(如无抑制剂残留)。

  2. 样品定量与质量检测

    • 使用分光光度计或荧光计检测核酸浓度和纯度(260/280比值在1.8-2.0之间)。

    • 通过电泳确认样品完整性。


(2) 配制PCR反应体系

  1. 选择试剂

    • 根据实验需求选择荧光染料法(如SYBR Green)或荧光探针法(如TaqMan探针)。

  2. PCR反应混合液配制
    按以下配比准备PCR反应液(总反应体积10-50 μL):

    • 模板DNA或cDNA(1-100 ng);

    • 引物(正向和反向,引物浓度一般为200-500 nM);

    • 荧光染料或探针(探针浓度一般为100-200 nM);

    • dNTPs、Taq DNA聚合酶和缓冲液;

    • 去离子水补足反应体积。

  3. 分装反应液

    • 将PCR反应液分装至96孔或384孔光学反应板中,每孔体积一致,避免气泡产生。

    • 进行密封(使用光学透明薄膜或封板盖)并短时间离心,使反应液集中到底部。


(3) 仪器检查

  1. 检查仪器是否已正确连接到电源和电脑。

  2. 打开仪器软件,确保光学模块和温控模块运行正常。

  3. 检查反应板对齐是否正确,避免样品孔偏移影响荧光信号采集。


2. 实验运行阶段

(1) 加载反应板

  1. 打开仪器样品舱门,将密封好的反应板或试管架放置在托盘上。

  2. 确保反应板正确对齐,避免孔位偏移影响光学检测。

(2) 设置实验参数

在赛默飞软件(如QuantStudio或7500软件)中进行实验设置:

  1. 实验类型选择

    • 绝对定量:用于精确定量目标核酸。

    • 相对定量:用于基因表达变化分析。

    • 熔解曲线分析:检测扩增产物的特异性或突变分析。

    • 根据实验目标选择适合的实验类型,如:

  2. 样品信息输入

    • 定义样品名称、分组信息和孔位分布。

    • 设置目标基因和参考基因的信息。

  3. 荧光通道设置

    • 根据荧光探针或染料选择检测通道(如FAM、VIC、SYBR Green等)。

  4. 热循环程序设置
    常规PCR循环参数如下:

    • 变性:95℃,15秒;

    • 退火/延伸:60℃,30秒;

    • 初始变性:95℃,2分钟;

    • 循环阶段(重复30-40次):

    • 熔解曲线分析(如适用):从60℃升温至95℃,每0.5℃记录荧光信号。

(3) 启动实验

  1. 确认所有参数无误后,点击 “运行实验"

  2. 仪器开始循环加热并实时采集荧光信号,生成扩增曲线。


3. 实验完成与数据分析阶段

(1) 检查实验完成状态

  • 仪器完成实验后,软件会提示实验成功完成。

  • 取出反应板并安全存放,以备后续验证或重复实验。

(2) 数据分析

  1. 查看扩增曲线

    • 检查扩增曲线是否呈现典型的S形曲线,确认扩增反应的有效性。

    • 平稳的S形曲线表明扩增反应正常。

  2. Ct值计算

    • Ct值(Threshold Cycle)是荧光信号达到设定阈值的循环数。Ct值越小,说明模板起始量越高。

    • 软件会自动计算每个样品的Ct值。

  3. 标准曲线分析(用于绝对定量):

    • 根据标准品的Ct值绘制标准曲线,计算未知样品的浓度。

  4. 相对定量分析

    • 比较目标基因与参考基因的表达水平,计算相对表达量(通常使用ΔΔCt法)。

  5. 熔解曲线分析(用于SYBR Green染料法):

    • 检查扩增产物的特异性。单一峰值表明扩增特异性良好;多峰值可能提示非特异性扩增或引物二聚体形成。

(3) 数据导出与保存

  • 将实验数据保存为软件支持的文件格式(如 .eds 或 .xls),便于后续分析和报告撰写。


4. 仪器清理与维护

(1) 清理样品托盘

  • 实验完成后,用无尘布清洁样品托盘,确保无残留液体或杂质。

(2) 光学模块清洁

  • 每周用光学专用清洁液轻轻擦拭光学窗口,避免灰尘或指纹干扰荧光检测。

(3) 定期校准

  • 每3-6个月校准一次温控模块和光学检测系统,确保仪器性能稳定。


5. 注意事项

  1. 样品制备

    • 确保核酸样品无污染,提取过程使用无RNase、无DNase的耗材。

    • 模板浓度适中,避免过量或过稀导致非特异性扩增。

  2. 试剂配制

    • 使用新鲜的试剂,避免因试剂降解导致实验失败。

  3. 仪器环境

    • 将仪器放置在干燥、无振动的实验环境中,保持室内温度和湿度稳定。

  4. 操作规范

    • 密封反应板时,确保无气泡干扰光学检测。

    • 运行实验时避免中途打开样品舱门。


总结

赛默飞实时荧光定量PCR仪的工作流程涵盖样品准备、仪器设置、实验运行和数据分析等多个环节。通过严格遵守标准操作流程和注意事项,用户可以充分利用仪器的高灵敏度和高精度特点,获得可靠的实验数据。同时,定期维护和校准仪器可以确保长期稳定的性能,为实验室研究提供强有力的技术支持。


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