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发布时间：2024/12/27
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以下是 赛默飞 QuantStudio Q5 实时荧光定量PCR仪 的标准操作规程（SOP）。此规程涵盖实验前准备、仪器操作、实验设置、运行和数据分析的步骤。
确保仪器接通电源并处于正常工作状态。
打开 QuantStudio Q5 仪器和配套的软件系统。
检查仪器光学模块是否清洁，无尘无污染。
确认实验室环境稳定（温度20-25°C，湿度40-60%），避免灰尘干扰。
准备 PCR 反应所需试剂和耗材：
样本模板（DNA 或 RNA 转录的 cDNA）。
引物和探针（根据靶标基因设计）。
荧光定量PCR试剂（如SYBR Green Master Mix或TaqMan Master Mix）。
96 孔板或 0.2 mL PCR 管，以及光学透明封板或封膜。
无菌移液器、滤芯吸头。
以下是 20 µL 体系的标准配方示例：
| 成分 | 体积（µL） | 说明 |
|---|---|---|
| PCR Master Mix | 10 | 含有聚合酶、dNTP、Mg²⁺等 |
| 上下游引物（10 µM） | 0.5 各 | 根据靶基因调整浓度 |
| 探针（10 µM）或染料 | 0.5 | 如 TaqMan 探针或 SYBR Green |
| 模板 DNA/cDNA | 1-2 | 根据样本浓度调整体积 |
| 无核酸酶水 | 至 20 µL | 补足总反应体系体积 |
反应体系混合时保持在冰上操作。
混匀后轻微离心，避免产生气泡。
使用负对照（无模板对照）和正对照，确保实验的可靠性。
打开 QuantStudio Q5 实时荧光定量PCR仪。
启动配套软件（QuantStudio Design and Analysis Software）。
选择“新建实验"以创建实验文件。
实验类型选择：
绝对定量：用于计算 DNA 或 RNA 的绝对拷贝数。
相对定量：用于基因表达水平比较。
溶解曲线分析：检查 PCR 产物的特异性。
基因分型：分析基因突变和 SNP。
板型设置：
根据实验需求选择 96 孔或 384 孔板格式。
为每个孔输入样本名称（如标准品、未知样本、对照组）。
荧光染料设置：
根据使用的染料或探针设置相应的荧光通道（如 FAM、VIC、ROX）。
启用 ROX 参考染料（如果试剂中包含）。
热循环程序：
初始变性：95°C，2-10 分钟。
循环反应（40 次循环）：
95°C，15 秒（变性）。
60°C，30-60 秒（退火和延伸，荧光信号采集阶段）。
设置标准 PCR 循环程序：
如果需要溶解曲线分析，加入升温梯度（如从 60°C 至 95°C）。
将已封装好的 PCR 板或管放入样本托盘。
确保 PCR 板放置平稳，并封膜牢固，避免蒸发。
关闭样本舱门，确保仪器密封。
检查设置无误后，点击 “运行实验"。
仪器开始运行，同时采集荧光信号。
在运行过程中，实时监测扩增曲线以确认扩增反应正常。
仪器运行时，软件界面会显示扩增曲线的实时变化。
检查所有样本的荧光信号是否正常累积。
Ct 值（循环阈值）： 自动计算每个样本的 Ct 值，Ct 值越低，样本初始浓度越高。
对照标准品生成标准曲线，用于绝对定量计算样本浓度。
检查 PCR 产物是否特异性扩增。
特异性扩增应显示单一峰值，非特异性产物会有多个峰值。
将分析结果（扩增曲线、Ct 值表、溶解曲线等）保存为 Excel、PDF 或图片格式。
确保实验数据备份并存档。
实验完成后，取出样本板并清理托盘。
用无尘布轻轻擦拭仪器内部，防止样本残留。
定期清洁光学模块，保持荧光检测的灵敏度。
如果出现荧光信号异常，需校准光学模块。
按照仪器使用手册，每 3-6 个月对温控模块进行校准，确保温度一致性。
定期检查软件版本，安装赛默飞发布的最新补丁或更新。
样本操作
使用无核酸酶污染的耗材和移液器。
避免模板 DNA 交叉污染。
试剂保存
荧光染料和酶类应按照试剂说明存放（如 -20°C 冷冻）。
使用前确保试剂混匀。
实验运行
在运行过程中不要随意中断仪器运行，防止数据丢失。
若出现异常终止，记录故障代码并联系赛默飞技术支持。
赛默飞 QuantStudio Q5 荧光定量PCR仪以其灵活性和高精度著称，是中小型实验室开展基因定量分析的理想工具。严格按照操作规程（SOP）进行实验，可提高实验结果的可靠性和可重复性，同时确保仪器的长期稳定运行。
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