赛默飞荧光定量PCR仪操作指南:步骤、技巧与注意事项

以下是赛默飞荧光定量PCR仪（以QuantStudio 5为例）的操作指南，包括详细步骤、实用技巧以及使用过程中的注意事项，旨在帮助用户规范使用流程，提升实验效率与数据准确性。

一、实验准备阶段

1. 仪器检查

• 打开设备电源，检查是否正常启动；

• 查看触摸屏界面是否响应灵敏；

• 确认仪器运行环境清洁，通风良好；

• 检查样品槽与加热盖是否干净、无异物。

2. 耗材准备

• 使用推荐的96孔PCR板、光学封板膜或8联管；

• 检查耗材是否变形、污染；

• 使用匹配的荧光探针或染料（如SYBR Green、TaqMan探针等）。

二、实验步骤

步骤一：反应体系配置

配置原则：

• 所有反应体系在冰上操作，避免酶失活；

• 设置阴性对照（NTC）和阳性对照，确保结果可靠。

常见反应体系（20μL）示例：

步骤二：样本加载

• 使用多道移液器将反应体系均匀分装到PCR板中；

• 避免气泡产生，可轻轻离心板子消除气泡；

• 使用光学封板膜密封，确保密封性和光学透明性；

• 标记板子边角，便于后续在软件中定位样本孔。

步骤三：加载PCR板并设置程序

1. 打开仪器上盖，将样品放入样品槽中；

2. 合上上盖（带加热盖）；

3. 在QuantStudio软件中：

   mathematica复制代码初始变性：95°C，2分钟  PCR循环：95°C 15秒 → 60°C 1分钟，40个循环  （如需熔解曲线，添加最后一步）

• 选择实验模板（绝对定量/相对定量/熔解曲线分析等）；

• 输入样品信息（样品名、通道、探针染料等）；

• 设置扩增程序，例如：

4. 点击“Start Run"启动实验。

三、实验后数据处理

1. 实时监控

实验过程中可实时查看荧光曲线；确认每个样本扩增是否符合预期（有无拖尾、迟滞、漂移等异常）。

2. 数据分析

• 完成后，使用软件自动分析Ct值；

• 可进行标准曲线构建、表达量分析（ΔCt、ΔΔCt）等；

• 导出数据为Excel、PDF、图像等格式用于报告或发表。

四、实用技巧

五、注意事项

操作方面

• 所有试剂应现配现用，并于冰上操作；

• 每次使用前检查仪器光学系统及样本槽是否干净；

• 加热盖温度建议比退火/延伸温度高5°C，以防蒸发。

软件使用

• 正确设置每个孔的荧光染料通道和样本分组；

• 使用模板保存实验设置，减少重复录入；

• 实验结束及时保存原始文件以备追踪。

仪器维护

• 每月用无尘布或酒精棉清洁仪器表面；

• 避免将液体洒入仪器内部；

• 定期校准温控和光学模块（可联系厂家技术服务）。

六、小结

赛默飞QuantStudio 5荧光定量PCR仪凭借稳定的性能和便捷的操作，在各类分子生物实验中发挥了重要作用。通过规范的操作流程、优化的实验设置和细致的维护管理，用户可以获得准确、稳定、重复性良好的检测结果。掌握操作技巧和注意事项，不仅能提升实验效率，也有助于减少实验失败和数据偏差。对于长期开展qPCR实验的实验室，建立标准操作流程（SOP）尤为重要。