一、使用前的准备工作

1. 样本准备

细胞计数仪的准确性很大程度上依赖于样本的质量。在操作前，应确保样本处理符合以下原则：

• 细胞状态：细胞应处于良好的形态，悬液中尽量无团聚现象。必要时可轻轻吹打或短时低速离心后重悬。

• 浓度范围：确保细胞浓度在仪器建议范围内，一般在 1×1041 \times 10^41×104 到 1×1071 \times 10^71×107 cells/mL 之间。浓度过高会导致计数不准，浓度过低则增加统计误差。

• 染色处理：如需检测活率，可根据实验目的加入台盼蓝（Trypan Blue）、碘化丙啶（PI）或 AO/EB 等染料，并按说明混匀。

• 缓冲液：尽量使用等渗的无钙镁 PBS、HBSS 或专用细胞稀释液，以减少细胞应激和裂解。

2. 仪器检查与校准

• 电源与接口：确保仪器连接稳定，无松动或损坏。

• 光学系统：检查光学镜头和成像窗口是否干净，可用无尘纸蘸无水乙醇轻轻擦拭。

• 校准液检测：部分型号需在使用前通过标准微球或校准液进行光学和计数精度校准。

• 软件更新：确认分析软件为最新版本，保证算法稳定性和兼容性。

二、操作步骤

以下为通用自动化细胞计数仪的操作流程，不同型号可在细节上有差异，但核心步骤相似。

1. 开机与初始化

• 按下电源键，等待仪器完成自检。

• 软件界面加载后，选择“新建测量”或对应模式。

• 若有温控功能，可设置样本室温度（一般室温或 37℃，视细胞类型而定）。

2. 样本加载

• 使用移液器吸取适量细胞悬液（通常 10–20 μL）。

• 若使用一次性计数芯片，将样本缓慢注入芯片入口，避免产生气泡。

• 若为可重复使用计数池，应先用缓冲液清洗，再加载样本。

• 确保样本均匀分布，避免在通道中沉降或聚集。

3. 选择检测模式

根据实验需求选择：

• 总细胞计数模式：不区分活细胞和死细胞，仅统计总量。

• 活/死细胞分析模式：结合染色结果，分别统计活细胞数和死细胞数，并计算活率。

• 多参数分析模式：在流式型或荧光型计数仪中，可检测细胞大小分布、荧光强度、颗粒杂质比例等。

4. 参数设置

• 选择适合的放大倍数、曝光时间和阈值。

• 调整聚焦位置，确保细胞轮廓清晰。

• 设置最小/最大直径筛选值，以排除碎片或非细胞颗粒。

• 若使用荧光通道，需选择对应激发光和滤光片组合。

5. 计数与分析

• 点击“开始检测”，仪器将自动采集图像或信号，并进行分析。

• 计数结果会以表格和图形显示，包括总细胞数、活率、平均直径等数据。

• 检查图像或直方图，确认算法对细胞识别的准确性，必要时可调整阈值重新分析。

三、检测后的数据处理

1. 数据保存与导出

• 保存原始图像与分析结果，建议建立实验日期与样本编号的文件夹。

• 导出数据为 Excel、CSV 或 PDF 格式，方便后续统计分析。

• 对需要长期保存的原始文件，可备份到实验室服务器或云端。

2. 结果解读

• 细胞浓度：用于计算后续实验所需接种量。

• 活率：低活率可能提示细胞受损或培养条件不佳。

• 大小分布：异常偏小可能为细胞凋亡，偏大可能为细胞融合或聚集。

四、清洁与维护

1. 每日清洁

• 检测结束后，使用去离子水或专用清洗液冲洗样本通道，防止残留堵塞。

• 清洁计数池或芯片接口，避免干涸残留物影响光学检测。

2. 定期维护

• 每周检查光学镜头和荧光模块的洁净度。

• 每月运行一次厂家提供的校准程序。

• 定期更换过滤器或耗材（如 O 型圈、进样针）。

五、使用中的注意事项

1. 避免气泡：样本注入计数池时若有气泡，会造成光路折射异常和计数误差。

2. 避免高浓度：过浓的样本易引起细胞重叠计数错误，可适当稀释。

3. 防止交叉污染：不同样本之间必须清洗进样通道或更换芯片。

4. 及时检测：细胞悬液放置时间过长会沉降或死亡，影响结果。

5. 染料比例：活死染色时染料过量会导致假阳性，过少则无法准确染色。

6. 对照设置：对于荧光检测，建议设置未染色对照、单染色对照，以便阈值设定。

六、常见问题与排查

1. 计数异常偏低或偏高

• 检查是否设置了过高或过低的粒径阈值。

• 样本是否稀释或聚集不均匀。

• 光学系统或流路是否被污染。

2. 活率异常

• 检查染料有效期与保存条件。

• 确认染色时间是否过长或过短。

• 样本制备过程中是否存在物理或化学应激。

3. 设备无法聚焦

• 检查计数池是否放置正确。

• 清洁镜头和样本窗口。

• 检查样本中是否有大量杂质或沉淀。

七、提高实验准确性的技巧

1. 预混匀：检测前将细胞悬液轻轻混匀，防止沉降。

2. 多次计数取均值：对重要样本可重复检测 2–3 次，取平均值以减少偶然误差。

3. 合理染色：根据细胞类型选择合适的活死染料，避免非特异性结合。

4. 优化阈值：在软件中通过查看实时图像调整阈值，确保识别准确。

5. 温度控制：对温度敏感的细胞，检测过程中保持温控，减少死亡率。

八、总结

细胞计数仪在细胞生物学研究和临床检测中具有操作简便、速度快、重复性好等优点。正确的使用方法不仅包括标准的操作流程，还需要掌握样本处理技巧、数据分析方法和日常维护要点。熟练掌握这些细节，可以显著提高实验数据的准确性与可重复性，为后续的细胞培养、药物筛选或临床检测提供可靠的基础数据支持。