罗氏实时荧光定量PCR仪（qPCR）原理

一、基本原理概述

实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR, qPCR）是传统PCR技术与荧光探针检测技术的结合。

PCR扩增：通过热循环（变性—退火—延伸），指数式扩增目标DNA片段。
荧光检测：在扩增过程中引入荧光染料或特异性探针，扩增产物的增加会导致荧光信号同步增强。
实时监测：罗氏 qPCR 仪配备高灵敏度光学检测系统，可在每个循环结束后实时记录荧光信号变化，从而实现扩增动态的全程追踪。

这样，研究人员不再依赖末端产物（如电泳），而是通过曲线直接得到定量和定性信息。

二、荧光信号检测原理

罗氏 LightCycler 系列支持多种荧光检测方式，主要包括：

非特异性染料法（如 SYBR Green）

染料仅在与双链DNA结合时发出荧光。
随着PCR产物增加，荧光信号增强。
适合基因表达分析，但可能受引物二聚体或非特异性扩增干扰。

特异性探针法（如 TaqMan 探针、FRET 探针）

TaqMan 探针：在5’端带荧光基团，3’端带淬灭基团。探针与模板结合后，在延伸过程中被Taq酶切割，释放荧光。
FRET（荧光共振能量转移）：通过两种染料之间的能量转移来检测产物。
特异性强，适合病原体检测、突变识别等临床应用。

三、定量分析原理

1. 扩增曲线与Ct值

Ct值（Threshold Cycle）：荧光信号达到阈值时的循环数。
Ct值与初始模板拷贝数呈负相关，模板越多，Ct越小。

2. 定量方式

绝对定量：利用已知浓度的标准品绘制标准曲线，计算未知样本拷贝数。
相对定量：与内参基因比较（ΔΔCt法），得到目标基因的相对表达量。

四、熔解曲线分析原理

罗氏仪器还可通过 熔解曲线分析（Melting Curve Analysis） 来验证扩增产物特异性：

缓慢升温，监测双链DNA解链时的荧光下降。
不同片段的熔解温度（Tm）不同，可区分目标片段与非特异性产物。
应用于基因分型、突变检测和非特异性扩增排查。

五、罗氏 LightCycler 的技术特色

高精度温控：银块温控系统确保反应孔间温度差异极小，提高结果可重复性。
光学系统优化：多通道检测，避免荧光串扰，可同时检测多种探针。
实时曲线直观展示：用户可实时监控扩增曲线和熔解曲线，快速判断实验质量。

✅ 总结：
罗氏实时荧光定量PCR仪的核心原理是 将PCR扩增与荧光探针检测结合，通过在每个循环实时采集荧光信号，实现 核酸的定性、定量及特异性分析。其关键技术包括 Ct值定量分析 与 熔解曲线特异性验证，使其广泛应用于 基因表达研究、病原体检测、遗传学研究及临床诊断。