罗氏实时荧光定量PCR仪工作原理详解

一、引言

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）自上世纪80年代问世以来，极大地推动了分子生物学、医学检测、环境监测、法医学和食品安全等多个领域的发展。传统PCR的终点分析具有一定的局限性，仅能判断是否扩增成功，难以实现实时监控与定量分析。实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR，qPCR）技术应运而生，解决了这一问题。

罗氏公司研发的 LightCycler® 系列实时荧光定量PCR仪，基于实时荧光检测与热循环技术，集成了温控系统、光学检测模块及数据处理系统。本文将系统介绍其工作原理、技术结构及相关参数，为理解仪器操作原理和合理使用提供理论依据。

二、实时荧光定量PCR的基本原理

实时荧光定量PCR仪的核心在于实时监测DNA扩增过程中荧光信号的变化，通过荧光染料或探针报告扩增产物的累积量，最终实现对初始模板的定量分析。

其基本过程包括：

1. 模板扩增（DNA复制）

2. 荧光信号产生（通过染料或探针）

3. 信号采集与分析（每一循环实时读取）

1. 扩增原理

PCR扩增由三个基本步骤循环构成：

• 变性（Denaturation）：95°C，使双链DNA解链为单链；

• 退火（Annealing）：50–65°C，引物与模板DNA特异性结合；

• 延伸（Extension）：72°C，在Taq酶作用下合成新链。

每一轮扩增，理论上目标序列数量会倍增，经过30–40个循环后即可达到可检测水平。

2. 荧光标记方法

荧光定量PCR的实现依赖于荧光染料或探针系统的加入。目前主要采用以下几种检测体系：

• SYBR Green I染料：与双链DNA结合后发出荧光，适用于通用引物体系；

• TaqMan探针：结合目标序列后被酶切断产生荧光释放，特异性强；

• 分子信标（Molecular Beacon）与Scorpion探针：通过构象变化实现荧光释放；

• FRET探针：两个探针之间发生荧光共振能量转移，用于高特异性检测。

3. 荧光检测与Ct值概念

每一轮循环结束后，设备通过激发光照射样品，记录荧光强度变化。荧光值超过设定阈值的循环数被称为Ct（Threshold Cycle），其与起始模板数量呈负相关关系：

• 初始模板越多，Ct值越小；

• Ct值差异可反映样品间表达量差异。

通过绘制标准曲线或采用ΔΔCt法，可进行绝对或相对定量分析。

三、罗氏LightCycler® 系统构造与功能模块

罗氏 LightCycler® 实时荧光定量PCR仪由以下四大模块构成：

1. 温控系统

构造

• 使用帕尔贴元件进行快速加热与降温；

• 96孔金属模块与热盖形成封闭反应环境；

• 多点温度传感器进行实时监控与调节。

功能

• 确保每一孔温度一致；

• 准确执行复杂的热循环程序；

• 快速升降温缩短实验时间，提高效率。

2. 光学检测系统

光源

• 多通道激发光源（如LED）激发不同荧光染料；

• 激发波长稳定，能量可控。

检测器

• 采用光电二极管或光电倍增管；

• 不同波段滤光片组合可实现FAM、HEX、ROX、Cy5等染料识别。

工作流程

• 在每一循环结束后，系统进行荧光激发；

• 荧光信号通过光路系统传输至探测器；

• 同步读取多个通道信号，支持多重检测。

3. 样品托盘与反应板

• 采用标准96孔PCR板，方便兼容市场主流耗材；

• 热盖自动调节压力，防止蒸发；

• 金属材质确保良好的热传导性。

4. 控制与分析系统

• 通过USB或网络接口连接控制计算机；

• 使用 LightCycler® 软件进行程序设置、数据采集与图像分析；

• 支持实时曲线、熔解曲线、标准曲线绘制等功能。

四、典型检测流程解析

1. 实验设计

• 选择适合的荧光系统（染料或探针）；

• 设计特异性引物；

• 准备PCR反应体系（包含模板、引物、酶、dNTP等）；

2. 程序设置

在软件中设定热循环程序，包括：

• 预变性时间与温度；

• 每步温度、时间、循环次数；

• 采集荧光的通道与时间点。

3. 扩增及实时检测

• 启动反应，仪器自动执行升降温与荧光采集；

• 实时生成扩增曲线，观察反应动态；

• 监测不同通道间数据变化，判断是否为特异性扩增。

4. 数据分析

• 提取Ct值；

• 应用ΔCt或ΔΔCt法计算表达量变化；

• 生成标准曲线用于绝对定量；

• 判断熔解曲线是否存在非特异产物或引物二聚体。

五、熔解曲线分析原理（适用于SYBR Green法）

在扩增结束后，通过升温过程记录双链DNA解链产生的荧光下降，得到熔解曲线：

• 每一个特异产物对应一个特定的熔解温度（Tm）；

• 若存在多个Tm峰，提示可能存在非特异扩增或引物二聚体；

• 可通过曲线平滑、导数计算等方式进行图像识别。

六、影响荧光信号准确性的因素