实时荧光定量PCR仪简介

一、引言

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）是一种在体外扩增特定DNA片段的技术。自1983年诞生以来，PCR技术在生命科学研究、医学诊断、环境监测、食品安全、法医鉴定等领域得到广泛应用。随着分子生物学的发展，传统PCR已逐渐无法满足对灵敏度、准确性、定量能力的更高需求。因此，实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR，简称qPCR）应运而生。

实时荧光定量PCR仪是一种结合荧光探针或染料信号，实现DNA扩增与实时检测的高通量分子检测设备。本文将围绕其基本原理、仪器结构、工作流程、数据分析、技术优势及应用等方面进行系统介绍。

二、实时荧光定量PCR的基本原理

1. 核酸扩增原理

实时荧光定量PCR与传统PCR的基本扩增机制相同，均基于三步循环：

• 变性（Denaturation）：高温使双链DNA分离为两条单链；

• 退火（Annealing）：降低温度，使引物结合到模板DNA上；

• 延伸（Extension）：DNA聚合酶延伸引物，合成新的DNA链。

每个循环都会使目标DNA数量翻倍，经过30~45个循环后即可获得大量扩增产物。

2. 荧光定量原理

实时PCR通过加入荧光标记物，在每一轮扩增过程中同步检测荧光强度的变化，从而反映DNA的累积量。其定量方式主要有两种：

• 染料法（如SYBR Green）：染料可与双链DNA结合并发出荧光，随DNA浓度增加荧光增强。

• 探针法（如TaqMan探针、MGB、Molecular Beacon）：通过序列特异性探针的荧光信号变化监控扩增，特异性更高。

荧光信号被检测器记录，绘制出扩增曲线，从而实现定量分析。

三、仪器结构与功能模块

实时荧光定量PCR仪主要由以下几个部分组成：

1. 热循环模块

负责提供精确的温控环境，确保PCR扩增反应的温度条件，包括变性、退火、延伸及熔解过程。该模块通常采用半导体控温系统，温度控制精度在±0.1℃以内。

2. 光学检测系统

包含激发光源、滤光片、光路系统和荧光检测器。激发光源（如LED或激光器）激发荧光染料，荧光信号通过滤光片传输到CCD或光电倍增管进行记录。多通道检测系统可同时监控多种荧光信号，用于多重PCR反应。

3. 控制与分析软件

用于实验设置、数据采集、扩增曲线分析、Ct值计算、标准曲线建立、熔解曲线绘制等。软件界面通常具备参数可视化、结果导出、模板管理等功能。

4. 样本模块

样本通常装载于96孔、384孔或较小通量的反应板、管条中，有些仪器还支持快热系统以缩短反应时间。

四、工作流程

1. 样本准备

提取目标样本中的DNA或RNA（RNA需逆转录为cDNA），并准确定量。引物与探针设计需依据目标序列，避免二聚体和非特异性结合。

2. 配制反应体系

一般包括以下成分：

• DNA模板

• 上下游引物

• 荧光染料或探针

• PCR缓冲液、Mg²⁺、dNTPs

• 热启动DNA聚合酶

3. 设置程序参数

包括初始变性时间、循环次数、各阶段温度与时间、熔解曲线分析等。染料和探针类型不同可能需要调整检测通道。

4. 实验运行与数据采集

仪器自动完成循环扩增和荧光信号采集，实验结束后通过软件分析数据，获取Ct值、Tm值、扩增效率等信息。

五、Ct值与定量原理

1. Ct值定义

Ct（Cycle threshold）值是指荧光信号超过背景阈值所对应的扩增循环数。Ct值越小，代表初始模板浓度越高。

2. 相对定量与绝对定量

• 相对定量：使用内参基因作为对照，计算目标基因的表达变化，常用2^-ΔΔCt方法。

• 绝对定量：通过标准曲线法，根据Ct值与模板拷贝数的对数关系，精确测量未知样本中目标基因的拷贝数。

六、与传统PCR的比较