使用赛默飞实时荧光定量PCR仪测定Tm值的原理与应用

一、引言

聚合酶链式反应（PCR）是一种广泛应用于分子生物学、医学诊断、食品安全和环境检测等领域的核酸扩增技术。实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR, qPCR）在传统PCR的基础上引入了荧光探针或染料，使得反应进程可以实时监测。熔解温度（Tm，Melting Temperature）作为核酸双链解链过程中的一个关键参数，能够为引物特异性分析、突变检测、产物鉴别等提供重要依据。

赛默飞科技生产的实时荧光定量PCR仪因其灵敏度、通量和数据分析能力，在多个实验室中得到广泛使用。本文将详细介绍如何利用赛默飞实时荧光定量PCR仪进行Tm值的测定，并探讨该过程的技术原理、实验步骤及其应用价值。

二、Tm值的基本概念与意义

熔解温度（Tm值）是指双链DNA变性为单链时的温度，此时有50%的双链DNA分子解链。Tm值受DNA序列长度、GC含量、离子浓度、DNA浓度等因素影响。测定Tm值对于以下方面具有重要意义：

1. 引物和探针设计优化：确保扩增的特异性和效率。

2. 产物鉴别：通过熔解曲线识别不同的扩增产物或杂交探针的结合差异。

3. SNP和突变检测：通过微小Tm值差异区分单核苷酸变异。

4. 验证扩增特异性：避免非特异性扩增对结果造成干扰。

三、仪器原理与检测机制

赛默飞的实时PCR系统通常采用SYBR Green I或TaqMan探针等荧光标记方式来监测DNA扩增。对于Tm值测定，多采用SYBR Green染料，其在双链DNA存在时发出荧光，单链时荧光迅速降低。通过逐步升温并记录荧光变化，即可绘制出熔解曲线，进一步计算Tm值。

仪器通过以下机制测定Tm值：

1. 荧光信号采集：在升温过程中持续监测SYBR Green的荧光变化。

2. 熔解曲线分析：荧光信号随温度升高而下降，取导数（-dF/dT）后得到Tm峰值。

3. 软件计算与输出：赛默飞的软件可自动识别Tm峰值并输出精确数据。

四、实验准备与操作步骤

1. 试剂准备

• qPCR Master Mix（含SYBR Green）

• 引物（Forward/Reverse）

• 模板DNA

• 无RNA酶水

2. 反应体系配置（以20 µL体系为例）