罗氏LightCycler® 480荧光定量PCR仪说明书

一、仪器概述

罗氏LightCycler® 480荧光定量PCR仪是一种基于实时荧光定量PCR（qPCR）技术的分子生物学检测设备，用于核酸（DNA/RNA）的扩增和定量分析。该仪器采用光学检测系统，可在PCR扩增过程中实时监测荧光信号变化，并通过软件分析计算目标核酸的初始浓度。

LightCycler® 480适用于医学诊断、基础研究、食品安全检测、环境监测等领域，支持多重PCR检测，满足不同实验需求。

二、仪器组成

1. 硬件部分

• 温控模块：采用Peltier半导体温控技术，控温范围通常为4°C–99°C，升降温速率可达4.8°C/秒（视具体型号）。

• 光学检测系统：

• 激发光源：LED或卤素灯（视型号）。

• 检测通道：通常支持4–6个荧光通道（如FAM、HEX、ROX、Cy5等），可同时检测多种荧光信号。

• 样本承载系统：兼容96孔板或384孔板（视型号），部分版本支持多模块并行运行。

• 触摸屏控制面板（部分型号）：可直接进行基本操作和程序设定。

2. 软件部分

• LightCycler® 480 Software：提供实验设置、数据采集、分析和报告生成功能。

• 支持绝对定量、相对定量、熔解曲线分析、基因分型等模式。

• 可导出数据至Excel、PDF等格式。

三、工作原理

实时荧光定量PCR（qPCR）通过监测PCR扩增过程中荧光信号的累积来定量目标核酸。LightCycler® 480采用以下两种主要检测方式：

1. 基于探针的检测（如TaqMan探针）：探针与目标序列结合后，在扩增过程中被酶切，释放荧光信号。

2. 基于染料的检测（如SYBR Green）：染料结合双链DNA后发出荧光，但可能受非特异性扩增影响。

仪器在每轮PCR循环后采集荧光信号，生成扩增曲线，并通过阈值循环数（Ct值）计算初始模板量。

四、操作流程

1. 实验前准备

• 样本处理：提取DNA/RNA，测定浓度和纯度（如A260/A280比值）。

• 试剂准备：

• 选择合适荧光标记（探针或染料）。

• 配制PCR反应体系（模板、引物、探针、酶、dNTPs、缓冲液等）。

• 耗材选择：使用适配的96孔板或384孔板，避免气泡影响信号检测。

2. 仪器设置

1. 开机与初始化：

• 打开仪器电源，启动软件，进行光学校准（如需要）。

2. 创建实验程序：

• 设定PCR循环参数（预变性、变性、退火/延伸、循环次数）。

• 选择荧光检测通道（如FAM、HEX）。

3. 样本排布：

• 在软件中设定样本位置，标注标准品、待测样本、阴性/阳性对照。

3. 运行PCR

• 将反应板放入仪器，启动运行。

• 实时监测扩增曲线和荧光信号。

4. 数据分析

• 扩增曲线分析：软件自动计算Ct值，生成标准曲线（绝对定量）或ΔΔCt值（相对定量）。

• 熔解曲线分析（如使用SYBR Green）：确认扩增特异性。

• 数据导出：保存或打印结果。

五、应用领域

1. 医学诊断：

• 病原体检测（如新冠病毒、HIV、HBV）。

• 遗传病筛查（如地中海贫血、囊性纤维化）。

2. 科研实验：

• 基因表达分析（qRT-PCR）。

• SNP分型、突变检测。

3. 食品安全与农业：

• 转基因成分检测。

• 食源性致病菌（如沙门氏菌、大肠杆菌）鉴定。

4. 环境监测：

• 水体或土壤中的微生物检测。

六、注意事项

1. 实验优化

• 引物/探针设计：确保特异性，避免二聚体或非特异性扩增。

• 反应体系优化：调整Mg²⁺浓度、退火温度等参数。

2. 防污染措施

• 分区操作（试剂配制区、样本处理区、扩增区）。

• 使用UNG酶（尿嘧啶-DNA糖基化酶）防污染体系。

3. 仪器维护

• 日常清洁：定期用无尘布擦拭样本槽和光学部件。

• 校准：定期进行光学校准和温度验证。

• 避免长时间高负荷运行，以延长设备寿命。

七、常见问题与解决方案