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罗氏实时荧光量PCR仪说明书（使用与维护综合介绍）

一、产品概述

罗氏实时荧光量PCR仪是一类用于核酸扩增与定量分析的高精度检测设备，集温控系统、光学检测系统、软件分析平台于一体，可对DNA或cDNA进行定量、相对定量、熔解曲线分析、多重检测等多种实验任务。设备在扩增过程中同步采集荧光信号，实现对目标序列的实时监测，适用于科研、教学、医学检验、动植物检疫、食品与环境监测等实验场景。其核心优势在于温控均一性、光学稳定性、算法可靠性与人机交互易用性，能够在保证灵敏度与特异性的同时缩短实验周期、提升数据可重复性。

二、适用对象

本说明书面向具备分子生物学基础与实验室规范操作能力的人员，包括实验员、项目负责人与实验室质量管理人员。初次使用者建议在接受系统培训或在有经验人员指导下完成首轮实验。

三、工作原理简述

仪器在预设的循环程序下完成变性、退火与延伸等阶段的温度切换。荧光探针或染料在扩增反应中与目标序列结合后释放或增强荧光信号，光学模块于每一循环或指定周期进行采集，经信号处理与基线校正后生成扩增曲线与Ct/Cq值。通过标准曲线可实现绝对定量，通过ΔΔCt方法可实现相对定量；熔解曲线可用于判定产物特异性与杂合峰风险。

四、系统组成

1. 主机与热循环模块：提供快速、精准、均匀的温度控制；支持孔板或管条多规格耗材。

2. 光学检测模块：多通道激发与接收，兼容常见荧光染料/探针；具备通道间校正能力。

3. 控制与分析软件：包含方法编辑、实时监控、数据处理、报告生成、审计追踪等功能。

4. 附件与耗材：反应板/管、封板膜、校准板、专用工具包等。

5. 文档与记录：含操作指南、维护计划表、质控记录表与安全须知等模板。

五、安装与环境要求

• 放置位置：稳固台面，远离振动、强磁与直射光源；预留散热空间。

• 环境条件：建议恒温恒湿，洁净、干燥、无腐蚀性气体；避免粉尘与气溶胶聚集。

• 供电要求：独立稳压电源与可靠接地；必要时配备UPS以防止意外断电。

• 分区管理：核酸提取区、配置区与扩增区独立设置，单向流动，防止交叉污染。

• 开箱检查：核对清单、确认外观完整、配件齐全；记录设备编号与初始状态。

六、初次使用前准备

1. 完成温度与光学校准，设定通道配置；根据实验方案建立模板方法。

2. 准备阴性、阳性与无模板对照（NTC），必要时加入内参基因。

3. 检查耗材适配性与洁净度；确保移液器校准有效。

4. 在软件中新建项目与样本列表，明确板位布局、样本类型与生物学重复。

5. 依据SOP准备反应体系，建议在低温条件下快速配制并尽量减少开盖次数。

七、操作流程

1. 方法编辑：设置预变性、循环数、退火/延伸温度与时间；如需多重检测，合理分配荧光通道并设定采集点。

2. 装板与封板：确保体积一致、液滴居中无气泡；使用合适的封板膜并充分压实。

3. 上机与运行：将板放置于指定位置并校准方向；在软件中选择方法与项目后启动运行。

4. 实时监控：观察扩增曲线与基线；必要时调整阈值位置但避免运行中频繁更改。

5. 结束与取板：运行完成后缓慢开盖，立即封存或转移产物；做好废弃物的分类与消毒。

八、数据分析与报告

• 基线与阈值：采用稳定区间进行基线扣除；阈值应落在指数增长区。

• 标准曲线：使用系列稀释样本计算斜率与R²，评估扩增效率与线性范围。

• 定量方法：绝对定量依据拷贝数标准品；相对定量建议选取稳定内参并进行ΔΔCt计算。

• 多重检测：检查各通道峰形、交叉干扰与光谱溢出；必要时进行通道间校正。

• 熔解曲线：单一尖锐峰提示特异性好；多峰或肩峰需复核引物设计与反应条件。

• 报告输出：包含样本信息、方法参数、曲线图、Ct值表、标准曲线与判读结论；保留原始数据与审计日志以便追溯。

九、质量控制与合规

1. 对照体系：阴性对照应无扩增，NTC用于排查体系污染；阳性对照验证反应有效性。

2. 重复性：生物学与技术重复并行，评估Ct离散度并计算变异系数。

3. 性能确认：定期复核检出限、线性范围与扩增效率；在方法变更或批次更替时重新确认。

4. 文件化管理：保存SOP、原始记录、变更记录与定期审核表，确保实验可追踪。

十、试剂与样本管理

• 试剂分区储存并标注开启日期与失效期；低温保存、避光、防冻融反复。

• 样本前处理遵循无RNA/DNA酶污染原则；设专用移液工具与耗材。

• 使用前混匀与瞬时离心，确保体系均一；对高抑制样本可考虑稀释或加入适配添加剂。

十一、常见应用与方法要点

• 病原检测：选择特异性强的引物探针，设立严格的阴性对照与携带者阈值。

• 基因表达分析：优选表达稳定的内参，进行PCR效率校正与引物扩增区间优化。

• 拷贝数变异分析：结合标准曲线与参考片段，控制样本负载量与反应抑制因素。

• 熔解曲线分型：提升升温速度与采集密度以分辨微小Tm差异，避免染料饱和效应。

• 多重体系：控制引物探针浓度平衡，错峰退火温度以降低互相竞争与二聚体形成。

十二、维护保养

1. 例行保养：运行后清洁外壳与托盘，保持光学窗口洁净干燥；定期检查散热通道。

2. 校准周期：按计划进行温度与光学复核；记录校准日期与结果。

3. 耗材管理：使用推荐规格的反应板与封板膜，避免变形导致热接触不良。

4. 软件维护：定期备份数据库，保留多版本方法文件与审计追踪。

5. 停机与存放：长期停用前完成全面清洁与干燥，覆盖防尘罩并保持通风。

十三、故障排查（示例场景）

• Ct值异常升高：检查样本降解、反应抑制或移液误差；确认扩增效率与阈值位置。

• 无扩增或曲线不规则：核对引物探针有效性、退火温度与Mg²⁺浓度；排查引物二聚体。

• 多峰或杂峰：复核引物特异性与熔解曲线扫描设置；适当提高退火温度或优化缓冲体系。

• 通道间漂移：执行光学校准与通道间校正；避免荧光串扰与板位边缘效应。

• 重复性差：统一反应体积与装液顺序；控制板位温度均一性与密封完整性。

• 软件报错：核对方法参数、项目文件与存储路径；必要时导出日志以便技术支持判读。

十四、安全注意事项

• 佩戴实验室常规防护用品，避免试剂接触皮肤与黏膜。

• 对含高风险病原体的样本，使用相应生物安全等级的设施并进行灭活或密闭操作。

• 运行中勿开启热盖与光学舱盖；停机后待温度降低再取板。

• 废弃物分类处理，含核酸染料与化学品的废液按危废处置。

十五、优化建议

• 采用预混体系减少移液次数；设置装载顺序与时限，降低温漂与蒸发。

• 针对复杂基质样本，进行适度稀释或加入增强剂；必要时更换核酸提取策略。

• 建立“方法库”，将不同目标、不同通道组合的参数沉淀为模板，便于跨项目复用。

• 持续评估引物探针批间差异，设立入库验证指标与替代方案。

十六、记录与追溯

• 每次运行保留项目编号、操作者、日期、批次、方法版本与结果快照；

• 对异常结果形成偏差报告与纠正措施；

• 定期汇总关键质量指标（扩增效率、R²、Ct离散度、阳性符合率等），用于持续改进。

十七、常见问题解答（节选）

• 如何设定阈值？ 选择指数增长区的平稳段，使阴性对照不越阈，阳性样本落入线性响应范围。

• 多重检测如何避免串扰？ 选用光谱分离度高的染料组合，平衡引物浓度并进行单通道预验证。

• 标准曲线不稳定怎么办？ 重新配制系列稀释，确保混匀与瞬时离心；排查移液误差与吸附损失。

• 熔解曲线出现肩峰？ 复核引物设计与产物长度，优化退火温度与升温速率，必要时更换体系。

十八、附录：示例方法要点（仅作参考）

• 反应体积：10–25 μL范围内保持一致；

• 循环数：35–45循环视目标拷贝数与背景决定；

• 退火温度：依据引物Tm值优化，一般在55–65 ℃范围微调；

• 采集策略：末端采集或每循环采集按染料/探针特性选择；

• 熔解曲线：65–95 ℃缓慢升温并高密度采集，利于分辨相近Tm。

本说明书旨在为日常操作与质量管理提供系统化指引。请在规范的实验条件下开展检测，严格执行分区与防污染要求，做好方法确认与记录归档。通过对温控、光学、算法与操作流程的协同优化，能够获得更稳定的Ct值、更清晰的扩增曲线与更可靠的定量结果，从而支撑高频次、高通量与高可信度的分子检测工作。