赛默飞ABI 7500实时荧光定量PCR仪原理及应用详解

一、前言

ABI 7500实时荧光定量PCR仪是由Applied Biosystems公司开发并由赛默飞（Thermo Fisher Scientific）整合运营的一款经典qPCR平台。自推出以来，该仪器凭借其优良的性能表现、稳定的荧光检测系统、广泛的适用性与成熟的软件支持，成为全球科研机构、临床检测实验室以及生物技术企业广泛使用的分子检测工具。

ABI 7500以其精确的荧光定量能力、高度自动化的操作界面和灵活的实验设计支持，已成为实时PCR技术在各类分子生物学实验中应用的标志性设备之一。

二、基本原理

ABI 7500基于实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR）技术工作，其核心是通过荧光染料或荧光探针实时监控PCR扩增反应中目标核酸的复制情况。荧光信号的强度与扩增产物量直接相关，系统通过监测每个循环中的荧光变化，推算出初始模板浓度。

1. 荧光信号监测

在PCR反应中，荧光信号通常通过以下两种策略生成：

• 非特异性染料法（如SYBR Green）：与所有双链DNA结合，当扩增产物形成时，荧光强度增强。

• 特异性探针法（如TaqMan探针）：探针结合靶序列，被Taq酶裂解释放荧光基团，产生特异性信号。

2. Ct值概念

Ct值（Cycle Threshold）指荧光信号首次显著高于背景的循环数。Ct值越小，表明样本中靶基因起始拷贝数越多，反之亦然。ABI 7500通过准确测定Ct值，实现对核酸分子的绝对或相对定量分析。

3. 数据计算方法

• 绝对定量：建立标准曲线，以Ct值对应拷贝数。

• 相对定量：利用ΔCt或ΔΔCt方法，计算基因表达量相对于内参基因或参照组的变化倍数。

三、仪器组成与结构功能

ABI 7500主要由四大核心模块构成，分别负责样品温控、荧光采集、系统控制与软件数据分析：

1. 热循环模块

• 样本容量为96孔标准PCR反应板。

• 加热模块采用高导热金属材质，温控准确，升温速率约为2.5℃/秒，满足标准PCR程序。

• 温度均匀性控制在±0.5℃，确保每个孔位反应一致。

2. 荧光检测系统

• 配备高灵敏度光学采集系统，支持多通道检测，常见为FAM、VIC、ROX、SYBR、NED等。

• 采用光纤传输与CCD成像技术，荧光信号捕捉迅速且精确。

• 可实现多重反应，一孔检测多个靶标，提高检测效率。

3. 操作界面与控制模块

• 控制系统通过计算机操作，兼容Windows操作环境。

• 软件内置标准操作流程模板，便于快速实验设置。

• 实验运行中可实时显示扩增曲线和荧光变化图，直观掌握反应过程。

4. 软件分析平台

• ABI 7500配套软件支持定量分析、溶解曲线分析、基因分型、标准曲线绘制等功能。

• 支持Excel、PDF等格式导出，便于统计分析与文档归档。

• 提供实时质控提示，协助用户发现反应异常或污染。

四、技术特点与优势

1. 灵敏度高

ABI 7500可检测低至个位拷贝的核酸模板，适用于高灵敏度的样本检测需求，如病毒载量、残余DNA检测、单细胞分析等。

2. 多通道荧光检测

支持多达5种荧光染料同时运行，能够实现一孔多靶的多重反应，大幅提升数据通量和实验效率。

3. 系统稳定性强

仪器在连续高强度运行环境下仍保持扩增一致性，适合临床实验室和生物样本检测中心的大批量检测任务。

4. 软件操作简便

无需编程基础即可完成实验设计，图形化界面、拖拽式设置，降低使用门槛，适合初学者与经验用户。

5. 良好的兼容性

开放式平台，兼容绝大多数商业化试剂盒与通用耗材，无需专属配套产品，节省实验成本。

五、典型应用场景

ABI 7500广泛应用于科研和临床领域，主要包括：

1. 基因表达分析

• 通过ΔΔCt方法评估不同处理、组织或时间点间的mRNA表达变化。

• 可用于疾病模型研究、药物机制分析、基因调控研究等。

2. 病毒核酸检测

• 适用于各种病毒如HBV、HCV、HIV、SARS-CoV-2等核酸载量的准确测定。

• 常用于医院、疾控中心的临床诊断与流行病学研究。

3. 遗传突变识别

• 配合TaqMan探针，识别SNP、插入缺失突变（INDEL）等遗传位点。

• 适用于肿瘤分子分型、个体化用药筛查、遗传病基因携带检测。

4. 基因分型

• 利用不同荧光探针同时检测等位基因，进行人群基因型分析。

• 常用于法医DNA鉴定、亲缘关系确认、群体遗传结构研究。

5. 残留DNA检测

• 在生物制药过程中监测重组细胞残留核酸，符合GMP质量标准。

六、标准操作流程

ABI 7500的操作流程经过长期优化，保证高重复性与结果稳定性，标准操作流程如下：

第一步：反应体系准备

• 提取DNA或RNA，纯化并定量。

• 配制荧光PCR反应液，包括引物、探针或染料、模板等。

第二步：样品装板

• 将反应体系分装至96孔PCR板，封板后轻离心去除气泡。

第三步：程序设置

• 打开软件，选择合适的模板或自定义反应程序与荧光通道。

• 设定反应参数：变性温度、退火温度、循环次数等。

第四步：运行实验

• 插入反应板，启动程序，仪器自动进行热循环与荧光监测。

第五步：实时查看与数据分析

• 观察扩增曲线、熔解曲线（适用于SYBR Green法）判断反应状态。

• 分析Ct值，计算表达倍数或载量，输出定量结果图表。

七、数据解读与质量控制

ABI 7500提供多层次数据质量评估机制，帮助用户判断反应是否成功：

• 扩增曲线形态：标准S型曲线表明反应正常；斜率过缓或平台期波动需注意模板质量或反应体系问题。

• 熔解曲线分析：适用于SYBR Green法，单一峰值代表产物特异性好。

• 重复孔间差异：重复Ct值差值应＜0.5，确保扩增一致性。

• 阴阳性对照分析：设置阳性模板与阴性对照以判断实验污染或体系失效。

八、维护与使用建议

为了保障ABI 7500长期运行稳定，用户在使用过程中应注意：

• 定期清洁光路窗口与样品槽，防止灰尘影响荧光信号。

• 使用高质量封板膜避免蒸发造成荧光漂移。

• 软件定期更新，保持数据分析模块最新。

• 避免反应体系混合过程中产生气泡，影响读数。

• 实验后及时导出数据并进行备份存档。

九、未来发展方向

尽管ABI 7500已被广泛应用并形成稳定用户群，但随着技术演进，实时荧光定量PCR未来仍有以下发展趋势：

• 多重扩增能力提升：更高通道数、更高光学分辨率。

• 通量升级与自动化联动：与自动加样、提取系统对接，实现全流程一体化。

• 便携化应用拓展：适应现场快速检测需求，如突发疫情应急检测。

• AI辅助数据分析：引入机器学习算法优化曲线识别与异常判断。

• 与数字PCR融合：进一步提升超低丰度靶标的定量能力。

ABI 7500作为经典平台仍具备拓展潜力，特别是在临床分子诊断领域，其稳定性与可验证性是许多实验室选择其为主力设备的关键因素。

十、结语

赛默飞ABI 7500实时荧光定量PCR仪凭借其坚实的技术基础、高灵敏度、高通量能力与成熟的软件平台，已经成为分子生物学实验室、医院检验科和生命科学企业不可或缺的重要工具。它不仅为科研人员提供高质量的核酸检测结果，也为临床分子诊断奠定了坚实基础。

无论是进行基因表达研究、病毒核酸检测，还是执行药物筛选和遗传突变分析，ABI 7500都能提供准确、可靠、高效的数据支持。未来，随着技术迭代升级，其应用边界将不断拓展，为分子生物科学的发展持续注入动力。