一、仪器概述

ViiA 7 实时荧光定量 PCR 仪是 Thermo Fisher Scientific 推出的一款高性能平台，专为高通量、精密和自动化操作而设计。该仪器支持多种反应板格式（包括 96 孔、384 孔以及 TaqMan 微流控阵列卡），同时配备六通道检测系统，可进行多重荧光检测分析。其灵活性与兼容性使其在基础科研、转化医学、遗传病研究、临床试剂开发等领域应用广泛。

二、技术特性简要回顾

在介绍操作流程前，了解其核心性能对熟练使用至关重要：

• 多格式支持：兼容 96 孔（0.1 mL 和 0.2 mL）、384 孔反应板及 TaqMan Array 卡；

• 六通道荧光检测系统：可同时检测六种不同荧光染料；

• VeriFlex 热区技术：支持多温区控温，适合梯度优化实验；

• 高分辨率 CCD 检测系统：确保灵敏度和重现性；

• 自动开盖装置：提升上样便捷性，适配自动化平台；

• 完整软件控制平台：包括 ViiA 7 Software 和云端 Connect 平台。

三、实验准备工作

1. 实验室环境要求

• 温度保持在 18～25°C；

• 仪器置于无尘、防震的工作台；

• 禁止阳光直射，远离高频磁场或噪音源。

2. 设备预检查

• 检查电源是否稳定接通；

• 仪器主机电源开关位于背部右下角；

• 打开操作系统，确认软件正常加载，无错误提示。

3. 耗材准备

• 对应孔板（0.1 mL、0.2 mL 或 384 孔）；

• 密封膜或光学封板；

• 离心机或板式离心器；

• 移液器与无酶滤芯吸头；

• 荧光探针或 SYBR Green 反应混合液；

• DNA/cDNA 模板及引物。

四、操作步骤详解

1. 实验设计与设置

a. 启动软件

启动 ViiA 7 Software，登录用户账户。主界面包含以下模块：

• Experiment Setup（实验设置）；

• Plate Setup（孔板布局）；

• Run Method（运行方案）；

• Analysis（数据分析）；

• Report（报告生成）。

b. 新建实验文件

点击“New Experiment”，选择实验类型，如：

• 绝对定量（Standard Curve）；

• 相对定量（ΔΔCt）；

• SNP 分型；

• 熔解曲线分析（Melt Curve）；

• 拷贝数变异分析。

根据实验目的设定 PCR 反应体系，包括反应体积（一般为 10–25 µL）、荧光染料类型（SYBR Green 或 TaqMan）、是否使用参考染料（如 ROX）等。

c. 设定反应条件

典型三步 PCR 热循环设置如下：

• 初始变性：95°C，10分钟；

• 变性：95°C，15秒；

• 退火/延伸：60°C，1分钟（重复 40 周期）；

• 熔解曲线分析（如需）：60–95°C，增量为0.3°C。

可自定义热区（VeriFlex 模块）以优化引物退火温度。

d. 建立孔板图

在 Plate Setup 中配置：

• 每个孔的实验名称（Sample Name）；

• 靶基因名称（Target）；

• 引物/探针染料；

• 生物/技术重复设置；

• 阴阳性对照标注。

可以使用导入模板批量添加样品布局。

2. 上样与板封

a. 样品加样

• 按实验设计添加模板 DNA、引物、探针或染料；

• 使用滤芯吸头避免交叉污染；

• 加样完毕后将反应板轻轻离心，去除气泡。

b. 封板密封

• 使用光学封板确保密闭性；

• 若使用 Array 卡，将卡插入卡槽并校准；

• 检查无液体残留在板缘，以免污染加热模块。

3. 运行 PCR 反应

a. 放置反应板

• 打开上盖；

• 将孔板正确定向插入槽中；

• 系统会自动识别孔板类型。

b. 启动实验

• 点击“Start Run”；

• 软件将实时显示荧光扩增曲线；

• 实验时长根据循环次数及模块配置而定（通常40周期约需1小时30分钟）。

五、数据分析模块说明

实验完成后，系统自动切换至 Analysis 页面，展示扩增曲线、阈值线和结果表。

1. 设置阈值

• 软件可自动设定基线与阈值；

• 也可手动拖动阈值线，调整 Ct 计算；

• 确保阈值设定在线性对数放大阶段。

2. 绝对定量分析

• 导入标准曲线样品；

• 软件自动生成 Ct vs log(copy number) 标准曲线；

• 结果以 copies/µL 或 log10 表示。

3. 相对定量分析（ΔΔCt）

• 设定参考基因（如 GAPDH）；

• 选择校准样本作为相对值基础；

• 系统生成折叠变化（fold change）结果及误差柱状图。

4. SNP 分型分析

• 设定 VIC 和 FAM 荧光通道；

• 分析模块将自动绘制等位基因聚类图；

• 结果分为纯合、杂合和未定型。

5. 熔解曲线分析

• 曲线应具备单一峰值；

• 多峰表示非特异性扩增或引物二聚体；

• 可辅助判断反应体系优化程度。

六、结果导出与报告生成

• 可将实验数据导出为 Excel、PDF 或 TXT 格式；

• 报告中可包含样品列表、Ct 值、熔解曲线图等；

• 报告可自定义页眉、页脚、实验编号、签名位置等。

七、维护与注意事项

1. 仪器维护

• 每周清洁样品台；

• 定期检查热循环模块平整度；

• 使用原厂光学配件和板材；

• 若长时间停机，关闭电源，拔掉电缆。

2. 软件与固件更新

• 使用 Connect 平台可自动接收更新通知；

• 建议实验结束后立即备份数据至本地或云端。

3. 常见故障排查

八、应用场景扩展

• 基因表达分析：检测基因上调或下调趋势；

• 肿瘤突变识别：快速锁定特定 SNP；

• 病原体检测：高敏度核酸定量筛查；

• 药物筛选：评估基因反应活性；

• 拷贝数变异：用于遗传学研究与个体化医学；

• 临床基因诊断开发：配合TaqMan探针库使用。

九、总结

ViiA 7 实时荧光定量 PCR 仪器集成了六通道检测系统、灵活板型支持、精密热控和智能软件分析平台，为用户提供从样品制备到结果报告的一体化实时 PCR 解决方案。其高通量、高精度及自动化兼容特性使其适应当今科研与诊断环境的多样化需求。

在熟悉操作流程基础上，用户可以灵活扩展实验设计，实现如拷贝数变异分析、熔解曲线分型、单核苷酸多态性分型等高级应用，为精准医疗与分子研究提供强大支撑。