一、实验概述与准备工作

QuantStudio 5 实时荧光定量PCR系统广泛应用于基因表达分析、SNP分型、病原检测等领域。为确保数据准确可靠，操作流程需严格执行，涵盖设备开机、反应体系准备、程序设定、运行监控及后期分析等完整步骤。

二、实验前准备

1. 仪器检查

在开始实验前，用户应进行以下检查：

• 电源连接与主机状态：确认设备电源线连接良好，主机面板无异常指示灯。

• 样品仓清洁度：打开样品舱盖，确保反应板架与样品仓无灰尘、无残液污染。

• 通风状态：确保设备四周通风良好，避免过热影响温控精度。

• 软件环境检查：确认分析电脑已安装QuantStudio Design and Analysis软件，授权完整，版本符合实验需求。

2. 实验耗材准备

建议使用正规认证耗材，避免非匹配板、盖或管导致数据误差：

• 96孔荧光定量PCR板（光学透明底）

• 光学密封膜或专用盖

• 微量移液器与滤芯枪头

• 冰盒、PCR工作站或洁净操作平台

三、反应体系配置

1. 实验设计确认

在开始配制之前，应清晰确定以下参数：

• 目标基因与引物序列

• 参考基因用于标准化Ct值

• 样品组别与生物学重复次数

• 使用染料：SYBR Green 或 TaqMan 探针

• 是否需要熔解曲线分析

2. 反应体系标准组成（以20 µL体系为例）

若使用探针法，应将探针（通常为10 µM）加入反应体系中，同时调整ddH₂O体积保持体系总体积恒定。

3. 注意事项

• 所有反应组分应在冰上操作，避免酶失活。

• 操作中尽量减少气泡产生，气泡会影响光学读取信号。

• 建议配置1–2个无模板对照（NTC）以检测污染。

四、PCR板封装与上机

1. 装板与封膜

• 将配置好的反应液依序加入96孔板中，对照板架图进行排布记录。

• 盖上光学密封膜，确保密封紧密，避免蒸发。

• 轻轻离心（约1000 rpm，30 秒）以除去气泡并使液体沉于孔底。

2. 上机步骤

• 打开QuantStudio 5 仪器舱门，将96孔板准确放入样品托盘。

• 注意孔板方向，确保A1位置朝前左上角。

• 关闭舱门，准备软件设置。

五、程序设置与实验运行

1. 软件打开与项目创建

• 启动QuantStudio软件，点击“新建实验”。

• 选择实验类型：标准曲线法、相对定量、绝对定量、SNP检测等。

• 命名项目并选择相应反应板类型（96-Well Fast/Standard）。

2. 荧光通道与探针设定

根据所用染料和探针设定通道：

• SYBR Green：常选FAM通道

• TaqMan探针：依据荧光标记物选择（FAM、VIC、HEX等）

3. 温控循环程序设定（以SYBR Green为例）

对于不同引物和酶体系，具体温度和时间应根据优化结果设定。

4. 样本标注

• 在软件中导入样本信息或手动填写，包括样本名称、组别、目标基因名、参考基因等。

• 勾选所需孔位对应的检测通道。

5. 开始实验

• 仔细复核实验设置与孔位标注。

• 点击“开始运行”，设备将自动执行程序。

六、实验过程监控

在实验运行过程中，用户可通过软件实时查看以下信息：

• 荧光增长曲线：评估PCR扩增效率

• 仪器温度状态：监控升降温准确性

• 扩增图谱预览：识别异常曲线及时终止

一般情况下，整个PCR程序（含熔解曲线）耗时约1小时30分钟至2小时。

七、实验结束后的数据分析

1. 数据导出格式

完成扩增后，软件会生成.qpx实验文件，可导出为：

• .xlsx（Excel）

• .pdf（报告格式）

• .csv（用于R/Python统计分析）

2. 分析内容

相对定量（ΔΔCt法）

• 软件自动识别参考基因并归一化Ct值

• 生成相对表达量柱状图或热图

• 可导出标准误、显著性分析结果（需设定组别）

熔解曲线分析

• 评估特异性扩增情况

• 多峰提示非特异扩增或引物二聚体

• 无模板对照应无峰

绝对定量（标准曲线法）

• 输入已知拷贝数标准品Ct值，软件生成标准曲线

• R²值用于评估线性相关性

• 斜率用于推算扩增效率（理想值为–3.3，效率约100%）

八、实验后的设备维护

1. 关闭与清洁

• 实验结束后，取出96孔板，封存保存（如需保存扩增产物）。

• 使用无尘布擦拭样品舱及仪器外壳。

• 定期清洁样本托盘与舱盖内侧，避免污染积累。

2. 软件与系统维护

• 定期检查软件更新，确保使用最新功能模块。

• 建议将实验数据同步至本地磁盘及云端双重备份。

九、常见问题与解决策略

十、结语

QuantStudio 5 实时荧光定量PCR仪不仅在硬件稳定性、光学灵敏度与数据处理能力方面表现优异，其完整的软件生态和用户友好界面也极大提升了实验效率和数据质量。掌握标准化操作流程，是保证qPCR实验可靠性和可重复性的关键。

即便在使用二手设备的情境下，只要严格遵守操作流程、做好维护保养，依然可以获得与新机相近的实验表现和数据质量。通过本文详尽步骤指南，希望为各类分子生物学实验室建立高质量PCR平台提供有力支持。