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赛默飞 ABI 7500 实时荧光定量PCR仪操作指南

赛默飞 ABI 7500 实时荧光定量PCR仪操作指南

Applied Biosystems 7500 实时荧光定量PCR仪（ABI 7500）是赛默飞（Thermo Fisher Scientific）推出的经典实时PCR平台之一，广泛应用于生命科学研究、分子诊断、病原体检测及基因定量分析等领域。该仪器具备高灵敏度检测能力、稳定的热循环系统和成熟的软件操作平台，能够实现对核酸样本的高效扩增与实时荧光监测。

熟练掌握ABI 7500的操作流程，不仅有助于实验成功，也能确保数据质量和实验重复性。以下内容将从设备准备、实验设置、反应体系搭建、运行过程、数据分析、常见问题处理与仪器维护七大模块系统介绍该仪器的使用方法。

一、实验准备与设备启动

1. 环境准备

  • 确保仪器放置在干燥、无震动的环境中；

  • 环境温度建议维持在18℃～25℃，湿度控制在60%以下；

  • 避免直射光和强磁干扰；

  • 仪器后方预留通风空间不少于10厘米。

2. 仪器启动步骤

  • 打开主机电源，系统自检开始；

  • 启动连接的计算机，打开ABI 7500专用软件；

  • 软件启动后，自动连接仪器，显示“Ready”状态。

二、PCR实验设计与反应体系配置

1. 实验设计

设计实验前需明确以下要素：

  • 检测目的（基因表达、绝对定量、病原检测等）；

  • 荧光方法（SYBR Green法或TaqMan探针法）；

  • 靶标基因与参考基因序列；

  • 引物及探针设计需考虑特异性、Tm值、二聚体风险；

  • 实验设置包括样本数、技术重复、标准曲线组数等。

2. 反应体系搭建（以20 µL体系为例）

组分体积（µL）
2× Master Mix10
正向引物（10 µM）0.4
反向引物（10 µM）0.4
探针（10 µM）0.2（TaqMan）
模板DNA2
ROX染料（如需）0.4
无RNA酶水补足至20 µL

注：ROX染料浓度根据使用的反应体系调整为Low ROX或High ROX，具体根据试剂说明书配置。

3. 反应板准备

  • 使用专用光学96孔板或八联排管；

  • 用移液器准确加样，避免气泡；

  • 用光学膜封板，确保密封良好；

  • 离心片刻，使液体集中在孔底。

三、软件操作流程

ABI 7500软件提供友好的人机交互界面，支持实验设计、运行监控与数据分析功能。

1. 创建新实验

  • 打开“7500 SDS Software”；

  • 点击“File” → “New Experiment”；

  • 选择实验类型：Standard Curve、Relative Quantitation、Genotyping 等；

  • 命名文件并保存。

2. 设置PCR反应程序

  • 默认热循环程序如下：

阶段温度时间循环数
初始变性95℃10分钟1
变性95℃15秒40
退火/延伸60℃1分钟40

  • 如为Fast模式，可将退火/延伸缩短至30秒；

  • 反应程序可自定义保存并复用。

3. 样本信息录入

  • 切换至“Plate Setup”页面；

  • 录入样本名称、靶基因名称；

  • 选择每孔的检测通道（FAM、VIC等）；

  • 设置是否包含标准样、阴性对照、参考基因等。

4. 启动运行

  • 确认样本板放入仪器；

  • 点击“Start Run”，仪器自动执行程序；

  • 可实时查看荧光信号曲线，监测扩增情况。

四、数据分析与结果解读

1. 实时曲线观察

  • 扩增曲线应呈“S”型；

  • 曲线平滑、Ct值间隔一致，代表扩增效率正常；

  • 若观察到多个平台或抖动，需排查试剂质量或移液问题。

2. Ct值计算与标准曲线

  • 软件自动识别基线与阈值，生成Ct值；

  • 若使用标准曲线法，可查看标准品线性关系与斜率；

  • 标准曲线效率理想值为90%～110%（斜率 -3.1至 -3.6）。

3. 相对定量分析

  • 选择参考基因与校准样本；

  • 系统自动计算ΔCt、ΔΔCt与表达倍数变化（2^–ΔΔCt）；

  • 可视化柱状图辅助表达差异观察。

4. 输出与保存

  • 结果可导出为Excel、CSV、PDF等格式；

  • 可生成多图合一实验报告，便于保存与发表。

五、实验注意事项

1. 引物探针设计原则

  • 引物长度18-25 bp，Tm值在58-60℃；

  • 避免重复序列、GC尾端或强互补序列；

  • 探针应设计在引物中间区域，防止与引物重叠。

2. 移液操作技巧

  • 使用校准移液器；

  • 每次更换枪头；

  • 尽量避免产生气泡；

  • 同一批次样品按固定顺序加样。

3. 板面密封与离心

  • 使用原装光学胶膜；

  • 板面封膜后建议在3000 rpm下离心30秒；

  • 防止挥发、气泡或样品不均影响扩增曲线。

六、常见问题与解决方法

问题现象可能原因解决方案
无扩增曲线模板浓度过低、酶失活检查模板质量，更新试剂
多条非特异曲线引物设计不良优化引物或提高退火温度
Ct值漂移大加样误差大增加技术重复，精准操作
曲线突跳或平台异常光学干扰或气泡确保耗材干净、样品无气泡

七、仪器维护与保养建议

  • 每次实验结束后，清理热循环模块，用无尘布擦拭残留物；

  • 每周检查热盖压力、散热风扇运行是否正常；

  • 每月进行软件备份、系统校准确认；

  • 定期联系厂家进行年度光学系统校准与维护；

  • 避免重复使用老化的光学板或损坏耗材，确保荧光信号稳定性。

八、结语

Applied Biosystems 7500 实时荧光定量PCR仪作为一款经典的qPCR平台，凭借其成熟的系统构架、稳定的反应条件和直观的软件设计，为生命科学与临床检测提供了高质量的核酸定量解决方案。掌握其标准化操作流程与优化策略，不仅可以提高实验效率，也能确保实验数据的准确性与可重复性。

对于科研人员而言，该设备是日常基因表达分析、病原检测、SNP分析等工作的强大工具。而对于临床实验室，它则是建立标准核酸检测流程的重要平台。通过科学管理与合理维护，ABI 7500将持续为实验室工作提供稳定支持。


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    赛默飞ABI 7500实时荧光定量PCR仪原理及应用详解
    一、前言
    ABI 7500实时荧光定量PCR仪是由Applied Biosystems公司开发并由赛默飞（Thermo Fisher Scientific）整合运营的一款经典qPCR平台。自推出以来，该仪器凭借其优良的性能表现、稳定的荧光检测系统、广泛的适用性与成熟的软件支持，成为全球科研机构、临床检测实验室以及生物技术企业广泛使用的分子检测工具。

    ABI 7500以其精确的荧光定量能力、高度自动化的操作界面和灵活的实验设计支持，已成为实时PCR技术在各类分子生物学实验中应用的标志性设备之一。

    二、基本原理
    ABI 7500基于实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR）技术工作，其核心是通过荧光染料或荧光探针实时监控PCR扩增反应中目标核酸的复制情况。荧光信号的强度与扩增产物量直接相关，系统通过监测每个循环中的荧光变化，推算出初始模板浓度。

    1. 荧光信号监测
    在PCR反应中，荧光信号通常通过以下两种策略生成：

    非特异性染料法（如SYBR Green）：与所有双链DNA结合，当扩增产物形成时，荧光强度增强。

    特异性探针法（如TaqMan探针）：探针结合靶序列，被Taq酶裂解释放荧光基团，产生特异性信号。

    2. Ct值概念
    Ct值（Cycle Threshold）指荧光信号首次显著高于背景的循环数。Ct值越小，表明样本中靶基因起始拷贝数越多，反之亦然。ABI 7500通过准确测定Ct值，实现对核酸分子的绝对或相对定量分析。

    3. 数据计算方法
    绝对定量：建立标准曲线，以Ct值对应拷贝数。

    相对定量：利用ΔCt或ΔΔCt方法，计算基因表达量相对于内参基因或参照组的变化倍数。

    三、仪器组成与结构功能
    ABI 7500主要由四大核心模块构成，分别负责样品温控、荧光采集、系统控制与软件数据分析：

    1. 热循环模块
    样本容量为96孔标准PCR反应板。

    加热模块采用高导热金属材质，温控准确，升温速率约为2.5℃/秒，满足标准PCR程序。

    温度均匀性控制在±0.5℃，确保每个孔位反应一致。

    2. 荧光检测系统
    配备高灵敏度光学采集系统，支持多通道检测，常见为FAM、VIC、ROX、SYBR、NED等。

    采用光纤传输与CCD成像技术，荧光信号捕捉迅速且精确。

    可实现多重反应，一孔检测多个靶标，提高检测效率。

    3. 操作界面与控制模块
    控制系统通过计算机操作，兼容Windows操作环境。

    软件内置标准操作流程模板，便于快速实验设置。

    实验运行中可实时显示扩增曲线和荧光变化图，直观掌握反应过程。

    4. 软件分析平台
    ABI 7500配套软件支持定量分析、溶解曲线分析、基因分型、标准曲线绘制等功能。

    支持Excel、PDF等格式导出，便于统计分析与文档归档。

    提供实时质控提示，协助用户发现反应异常或污染。

    四、技术特点与优势
    1. 灵敏度高
    ABI 7500可检测低至个位拷贝的核酸模板，适用于高灵敏度的样本检测需求，如病毒载量、残余DNA检测、单细胞分析等。

    2. 多通道荧光检测
    支持多达5种荧光染料同时运行，能够实现一孔多靶的多重反应，大幅提升数据通量和实验效率。

    3. 系统稳定性强
    仪器在连续高强度运行环境下仍保持扩增一致性，适合临床实验室和生物样本检测中心的大批量检测任务。

    4. 软件操作简便
    无需编程基础即可完成实验设计，图形化界面、拖拽式设置，降低使用门槛，适合初学者与经验用户。

    5. 良好的兼容性
    开放式平台，兼容绝大多数商业化试剂盒与通用耗材，无需专属配套产品，节省实验成本。

    五、典型应用场景
    ABI 7500广泛应用于科研和临床领域，主要包括：

    1. 基因表达分析
    通过ΔΔCt方法评估不同处理、组织或时间点间的mRNA表达变化。

    可用于疾病模型研究、药物机制分析、基因调控研究等。

    2. 病毒核酸检测
    适用于各种病毒如HBV、HCV、HIV、SARS-CoV-2等核酸载量的准确测定。

    常用于医院、疾控中心的临床诊断与流行病学研究。

    3. 遗传突变识别
    配合TaqMan探针，识别SNP、插入缺失突变（INDEL）等遗传位点。

    适用于肿瘤分子分型、个体化用药筛查、遗传病基因携带检测。

    4. 基因分型
    利用不同荧光探针同时检测等位基因，进行人群基因型分析。

    常用于法医DNA鉴定、亲缘关系确认、群体遗传结构研究。

    5. 残留DNA检测
    在生物制药过程中监测重组细胞残留核酸，符合GMP质量标准。

    六、标准操作流程
    ABI 7500的操作流程经过长期优化，保证高重复性与结果稳定性，标准操作流程如下：

    第一步：反应体系准备
    提取DNA或RNA，纯化并定量。

    配制荧光PCR反应液，包括引物、探针或染料、模板等。

    第二步：样品装板
    将反应体系分装至96孔PCR板，封板后轻离心去除气泡。

    第三步：程序设置
    打开软件，选择合适的模板或自定义反应程序与荧光通道。

    设定反应参数：变性温度、退火温度、循环次数等。

    第四步：运行实验
    插入反应板，启动程序，仪器自动进行热循环与荧光监测。

    第五步：实时查看与数据分析
    观察扩增曲线、熔解曲线（适用于SYBR Green法）判断反应状态。

    分析Ct值，计算表达倍数或载量，输出定量结果图表。

    七、数据解读与质量控制
    ABI 7500提供多层次数据质量评估机制，帮助用户判断反应是否成功：

    扩增曲线形态：标准S型曲线表明反应正常；斜率过缓或平台期波动需注意模板质量或反应体系问题。

    熔解曲线分析：适用于SYBR Green法，单一峰值代表产物特异性好。

    重复孔间差异：重复Ct值差值应＜0.5，确保扩增一致性。

    阴阳性对照分析：设置阳性模板与阴性对照以判断实验污染或体系失效。

    八、维护与使用建议
    为了保障ABI 7500长期运行稳定，用户在使用过程中应注意：

    定期清洁光路窗口与样品槽，防止灰尘影响荧光信号。

    使用高质量封板膜避免蒸发造成荧光漂移。

    软件定期更新，保持数据分析模块最新。

    避免反应体系混合过程中产生气泡，影响读数。

    实验后及时导出数据并进行备份存档。

    九、未来发展方向
    尽管ABI 7500已被广泛应用并形成稳定用户群，但随着技术演进，实时荧光定量PCR未来仍有以下发展趋势：

    多重扩增能力提升：更高通道数、更高光学分辨率。

    通量升级与自动化联动：与自动加样、提取系统对接，实现全流程一体化。

    便携化应用拓展：适应现场快速检测需求，如突发疫情应急检测。

    AI辅助数据分析：引入机器学习算法优化曲线识别与异常判断。

    与数字PCR融合：进一步提升超低丰度靶标的定量能力。

    ABI 7500作为经典平台仍具备拓展潜力，特别是在临床分子诊断领域，其稳定性与可验证性是许多实验室选择其为主力设备的关键因素。

    十、结语
    赛默飞ABI 7500实时荧光定量PCR仪凭借其坚实的技术基础、高灵敏度、高通量能力与成熟的软件平台，已经成为分子生物学实验室、医院检验科和生命科学企业不可或缺的重要工具。它不仅为科研人员提供高质量的核酸检测结果，也为临床分子诊断奠定了坚实基础。

    无论是进行基因表达研究、病毒核酸检测，还是执行药物筛选和遗传突变分析，ABI 7500都能提供准确、可靠、高效的数据支持。未来，随着技术迭代升级，其应用边界将不断拓展，为分子生物科学的发展持续注入动力。

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