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聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）自上世纪80年代问世以来，极大地推动了分子生物学、医学检测、环境监测、法医学和食品安全等多个领域的发展。传统PCR的终点分析具有一定的局限性，仅能判断是否扩增成功，难以实现实时监控与定量分析。实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR，qPCR）技术应运而生，解决了这一问题。
罗氏公司研发的 LightCycler® 系列实时荧光定量PCR仪，基于实时荧光检测与热循环技术，集成了温控系统、光学检测模块及数据处理系统。本文将系统介绍其工作原理、技术结构及相关参数，为理解仪器操作原理和合理使用提供理论依据。
实时荧光定量PCR仪的核心在于实时监测DNA扩增过程中荧光信号的变化，通过荧光染料或探针报告扩增产物的累积量，最终实现对初始模板的定量分析。
其基本过程包括：
模板扩增（DNA复制）
荧光信号产生（通过染料或探针）
信号采集与分析（每一循环实时读取）
PCR扩增由三个基本步骤循环构成：
变性（Denaturation）：95°C，使双链DNA解链为单链；
退火（Annealing）：50–65°C，引物与模板DNA特异性结合；
延伸（Extension）：72°C，在Taq酶作用下合成新链。
每一轮扩增，理论上目标序列数量会倍增，经过30–40个循环后即可达到可检测水平。
荧光定量PCR的实现依赖于荧光染料或探针系统的加入。目前主要采用以下几种检测体系：
SYBR Green I染料：与双链DNA结合后发出荧光，适用于通用引物体系；
TaqMan探针：结合目标序列后被酶切断产生荧光释放，特异性强；
分子信标（Molecular Beacon）与Scorpion探针：通过构象变化实现荧光释放；
FRET探针：两个探针之间发生荧光共振能量转移，用于高特异性检测。
每一轮循环结束后，设备通过激发光照射样品，记录荧光强度变化。荧光值超过设定阈值的循环数被称为Ct（Threshold Cycle），其与起始模板数量呈负相关关系：
初始模板越多，Ct值越小；
Ct值差异可反映样品间表达量差异。
通过绘制标准曲线或采用ΔΔCt法，可进行绝对或相对定量分析。
罗氏 LightCycler® 实时荧光定量PCR仪由以下四大模块构成：
使用帕尔贴元件进行快速加热与降温；
96孔金属模块与热盖形成封闭反应环境；
多点温度传感器进行实时监控与调节。
确保每一孔温度一致；
准确执行复杂的热循环程序；
快速升降温缩短实验时间，提高效率。
多通道激发光源（如LED）激发不同荧光染料；
激发波长稳定，能量可控。
采用光电二极管或光电倍增管；
不同波段滤光片组合可实现FAM、HEX、ROX、Cy5等染料识别。
在每一循环结束后，系统进行荧光激发；
荧光信号通过光路系统传输至探测器；
同步读取多个通道信号，支持多重检测。
采用标准96孔PCR板，方便兼容市场主流耗材；
热盖自动调节压力，防止蒸发；
金属材质确保良好的热传导性。
通过USB或网络接口连接控制计算机；
使用 LightCycler® 软件进行程序设置、数据采集与图像分析；
支持实时曲线、熔解曲线、标准曲线绘制等功能。
选择适合的荧光系统（染料或探针）；
设计特异性引物；
准备PCR反应体系（包含模板、引物、酶、dNTP等）；
在软件中设定热循环程序，包括：
预变性时间与温度；
每步温度、时间、循环次数；
采集荧光的通道与时间点。
启动反应，仪器自动执行升降温与荧光采集；
实时生成扩增曲线，观察反应动态；
监测不同通道间数据变化，判断是否为特异性扩增。
提取Ct值；
应用ΔCt或ΔΔCt法计算表达量变化；
生成标准曲线用于绝对定量；
判断熔解曲线是否存在非特异产物或引物二聚体。
在扩增结束后，通过升温过程记录双链DNA解链产生的荧光下降，得到熔解曲线：
每一个特异产物对应一个特定的熔解温度（Tm）；
若存在多个Tm峰，提示可能存在非特异扩增或引物二聚体；
可通过曲线平滑、导数计算等方式进行图像识别。
| 因素 | 影响表现 | 建议解决方法 |
|---|---|---|
| 荧光染料浓度 | 过高造成背景信号增加 | 优化反应浓度 |
| 引物二聚体 | 假阳性Ct值 | 设计引物时避免互补区 |
| 光学污染 | 信号不稳定或偏差大 | 定期清洁检测窗口 |
| 温控偏差 | 扩增效率不均 | 定期校准温控模块 |
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