赛默飞酶标仪 Multiskan EX 检测原理

一、设备概述

赛默飞（Thermo Scientific）Multiskan EX 是一款经典的微孔板酶标仪，主要用于光学吸收法检测微孔板中样品的吸光度变化。它广泛应用于酶联免疫吸附试验（ELISA）、蛋白定量、酶活分析、细胞增殖检测等生命科学与临床诊断领域。
该仪器的检测核心基于比尔–朗伯定律（Beer–Lambert Law），通过测量特定波长下光线穿过样品时的衰减程度，推算溶液中被测物质的浓度或反应程度。

二、核心光学原理

1. 比尔–朗伯定律

比尔–朗伯定律表述为：

$$A=\epsilon \cdot c\cdot l$$

其中：

• $A$：吸光度（Absorbance）

• $\epsilon$：摩尔吸光系数（Molar Absorptivity）

• $c$：溶液中物质浓度

• $l$：光程长度

在酶标仪中，光程通常由微孔板的液面高度决定，固定不变，因此吸光度与浓度成正比。

2. 光吸收检测过程

• 发光源（通常为卤素灯或氙灯）发出宽谱光。

• 滤光系统选出所需的单色光波长。

• 光线通过微孔板中的样品溶液时，部分能量被吸收。

• 透过光被光电探测器接收并转换为电信号。

• 仪器计算样品相对于参比孔的吸光度。

三、光路结构与信号处理

1. 光路组成

Multiskan EX 的光路一般包括：

1. 光源单元：提供稳定的光输出。

2. 滤光轮/滤光片组：选择检测波长，保证单色性。

3. 准直系统：通过透镜或光纤使光束平行、集中。

4. 样品承载平台：微孔板在读取过程中按行或按列移动至光路下方。

5. 光电探测器：常用硅光二极管（Si-PD），将光信号转为电信号。

2. 信号处理流程

• 光电探测器输出的模拟电信号经过放大与噪声滤除。

• 模拟信号经模数转换器（ADC）转为数字信号。

• 数字信号经计算机处理，与空白孔信号比较，得出吸光度值。

四、检测模式

1. 单波长检测

• 只使用一个波长测量样品的透射光强度。

• 适用于单一吸收峰的检测反应，如常规 ELISA 终点法。

2. 双波长检测

• 同时或依次测量主波长和参考波长的透射光。

• 参考波长用于校正光源波动、微孔板划痕或样品浑浊造成的干扰。

• 双波长吸光度公式：

A=(A主波长−A参考波长)A = (A_{\text{主波长}} - A_{\text{参考波长}})A=(A主波长−A参考波长)

3. 动态检测

• 在一定时间间隔内连续读取样品吸光度变化。

• 常用于酶动力学研究，如酶反应速率测定。

五、波长选择与滤光系统

1. 滤光片原理

• 滤光片通过选择性透过特定波长光，阻挡其他波长，实现单色化。

• Multiskan EX 采用固定波长滤光片，可根据实验需求更换不同波长（常用如 405 nm、450 nm、492 nm、620 nm）。

2. 波长选择对实验的影响

• ELISA 常用 450 nm 检测底物 TMB 的显色反应终点。

• 405 nm 常用于磷酸酶底物检测。

• 620 nm 常用于参考波长校正。

六、数据转换与计算方法

1. 吸光度计算

吸光度 $A$ 通过朗伯–比尔公式计算：

A=log⁡10(I0I)A = \log_{10} \left( \frac{I_0}{I} \right)A=log10(II0)

其中：

• I0I_0I0：空白孔透射光强度

• $I$：样品孔透射光强度

2. 浓度计算

若已知标准曲线，可通过插值法或回归方程计算未知样品浓度：

• 线性拟合：适用于低浓度范围。

• 四参数或五参数逻辑回归（4PL/5PL）：适用于非线性 ELISA 曲线。

七、影响检测精度的因素

1. 光源稳定性

• 光强波动会直接影响信号精度。

2. 滤光片性能

• 老化或污染的滤光片会降低单色性。

3. 样品体积与液面高度

• 光程变化会影响吸光度。

4. 微孔板质量

• 板底平整度和透明度影响光路。

5. 温度控制

• 酶反应对温度敏感，温度变化会改变反应速率。

八、典型应用案例与原理联系

1. ELISA 检测

• 酶与底物反应产生有色产物，吸光度与目标分子浓度成正比。

• 终点法测量单次吸光度，动力学法跟踪颜色变化速率。

2. 蛋白浓度测定（BCA 法、Bradford 法）

• 染料与蛋白结合后引起特定波长吸收峰增强。

• 通过标准曲线将吸光度转换为蛋白浓度。

3. 细胞活性检测（MTT、WST-1）

• 细胞代谢将底物转化为有色产物，颜色深浅反映细胞活性。

九、维护与校准在原理保障中的作用

1. 光学系统清洁

• 保持光路透镜和滤光片无灰尘、无污渍，确保光强稳定。

2. 光源更换与校准

• 定期检查灯泡光强，必要时更换，并进行波长与光强校准。

3. 参考标准板检测

• 使用已知透光率或吸光度的标准板检测仪器读数稳定性。

十、总结

Multiskan EX 酶标仪的检测原理以光吸收法为核心，通过精确控制光源、波长、光路以及信号处理，实现对微孔板中样品吸光度的高精度测量。比尔–朗伯定律为其提供了理论基础，双波长与动态检测等模式则提升了抗干扰能力与实验适用性。正确理解其检测原理，不仅有助于优化实验设计，还能在设备使用与维护中保证长期的检测精度与可靠性。