赛默飞酶标仪 Varioskan Flash 检测模式详解

一、设备概述

Varioskan Flash 是赛默飞（Thermo Scientific）推出的高端多模式酶标仪平台，能够在一台设备上实现多种光学检测模式，包括吸光度（Absorbance）、荧光强度（Fluorescence Intensity）、荧光偏振（Fluorescence Polarization）、时间分辨荧光（Time-Resolved Fluorescence）、发光（Luminescence）等。
其最大的特点是采用单色仪（Monochromator）技术覆盖从紫外到近红外的宽波长范围，配合灵活的软件控制和自动化样品处理能力，能够适应从基础科研到高通量筛选的多种需求。

二、检测模式分类

根据光学原理和信号类型，Varioskan Flash 主要支持以下检测模式：

1. 吸光度检测模式（Absorbance Mode）

2. 荧光强度模式（Fluorescence Intensity Mode）

3. 荧光偏振模式（Fluorescence Polarization Mode, FP）

4. 时间分辨荧光模式（Time-Resolved Fluorescence Mode, TRF）

5. 发光检测模式（Luminescence Mode）

6. 光谱扫描模式（Spectral Scanning）

7. 动力学检测模式（Kinetic Measurement）

三、各模式原理与应用

1. 吸光度检测模式（Absorbance）

原理
基于比尔-朗伯定律，通过测量样品在特定波长下对光的吸收程度（A 值）来推算其浓度或反应进程。Varioskan Flash 采用氙闪光灯光源与单色仪，可提供 200–1000 nm 范围的任意波长选择，波长步进精度 1 nm。

应用

• 核酸浓度与纯度检测（A260/A280）

• 蛋白质定量（Bradford、BCA、Lowry 法）

• ELISA 检测

• 细胞生长曲线测定

特点

• 支持单波长、双波长、全光谱扫描

• 光程自动修正

• 读取速度快，可实现高通量测定

2. 荧光强度模式（Fluorescence Intensity）

原理
利用激发光照射含有荧光分子的样品，分子吸收能量后发射特定波长的光，检测其发射强度。Varioskan Flash 可独立设置激发与发射波长，支持选择最佳光谱组合以获得最高信噪比。

应用

• 荧光染料定量（FITC、Cy5 等）

• 酶底物反应监测（如荧光素酶报告基因检测）

• 荧光标记抗体检测

• 离子浓度测定（钙离子探针 Fluo-4）

特点

• 激发/发射波长范围宽（200–1000 nm）

• 可进行激发扫描、发射扫描和二维光谱图绘制

• 高灵敏度，检测限低

3. 荧光偏振模式（Fluorescence Polarization, FP）

原理
当荧光分子被线偏振光激发时，其发射光的偏振程度与分子的旋转速度有关，而旋转速度与分子大小密切相关。通过测量荧光发射光在平行与垂直方向的强度差异，可以计算荧光偏振值。

应用

• 小分子与大分子结合研究（如药物与蛋白的相互作用）

• 受体-配体结合动力学

• 药物筛选（基于分子结合事件的 FP 高通量分析）

特点

• 无需分离步骤

• 适合均相检测体系

• 对微小分子大小变化敏感

4. 时间分辨荧光模式（Time-Resolved Fluorescence, TRF）

原理
利用部分荧光分子（如铕、铽配合物）具有长寿命荧光发射的特性，在激发光脉冲结束后延迟一段时间才采集信号，从而有效消除短寿命背景荧光和散射光，提高信噪比。

应用

• DELFIA 检测（基于铕标记的免疫分析）

• 高灵敏度均相免疫测定

• 复杂样品基质下的荧光检测（如血清、细胞裂解液）

特点

• 背景干扰极低

• 灵敏度高于普通荧光模式

• 适用于生物样品复杂背景下的信号检测

5. 发光检测模式（Luminescence）

原理
测量化学或生物反应过程中产生的光信号，不需要外部激发光源。信号可为闪光型（瞬时发光）或持续型（稳态发光）。

应用

• 荧光素酶报告基因检测

• ATP 定量

• 化学发光免疫分析

• 细胞毒性检测（基于发光底物）

特点

• 无激发光背景

• 动态范围宽

• 可检测极低水平的发光信号

6. 光谱扫描模式（Spectral Scanning）

原理
在一定波长范围内连续扫描样品吸光度或荧光发射强度，得到完整的光谱曲线。

应用

• 确定样品最佳激发/发射波长

• 分析混合物光谱特征

• 研究分子环境对光谱的影响

特点

• 单色仪可快速切换波长

• 扫描步长灵活可调（1–5 nm）

• 数据可用于实验优化和峰值分析

7. 动力学检测模式（Kinetic Measurement）

原理
在反应进行过程中以设定时间间隔连续测量信号变化，获得反应速率和动力学曲线。

应用

• 酶促反应速率测定（ΔA/min）

• 细胞代谢活性监测

• 发光衰减曲线测量

特点

• 时间分辨率高（秒级）

• 可设定混匀和温控条件

• 适合实时反应监控

四、模式切换与组合应用

Varioskan Flash 最大的优势之一是多模式组合检测：

• 同一样品可先进行吸光度测定，再进行荧光或发光检测。

• TRF 与 FP 可结合使用，兼顾灵敏度与结合信息。

• 动力学模式可嵌入任意光学模式，实现反应全过程监控。

模式切换无需更换硬件滤光片，单色仪直接调整波长即可完成，缩短实验准备时间。

五、数据分析与优化策略

1. 信噪比优化

• 选择样品信号峰值波长

• 使用参考波长或延迟采集减少背景干扰

2. 灵敏度调节

• 调整 PMT（光电倍增管）增益

• 在低信号实验中使用自动增益模式

3. 动态范围扩展

• 对强信号样品适当降低增益或缩短积分时间

• 高低浓度样品分批检测

4. 动力学分析

• 数据导出后进行 Michaelis-Menten 或其他动力学模型拟合

• 软件内置多种曲线拟合工具

六、注意事项

• 切换模式前确保样品容器与模式匹配（如黑板适合荧光，白板适合发光）

• 荧光和 TRF 模式需避免激发光直射眼睛

• 发光模式对环境光敏感，操作时应关闭舱门

• 吸光度测量需确保样品体积足够覆盖光路

七、应用案例

案例 1：ELISA 定量

使用吸光度模式在 450 nm 检测终点反应，并在 630 nm 参考波长扣除背景，构建标准曲线计算样品浓度。

案例 2：ATP 检测

发光模式检测细胞内 ATP 水平，信号与 ATP 浓度呈线性关系，检测限可达皮摩尔级。

案例 3：药物-蛋白结合研究

荧光偏振模式检测药物与荧光标记蛋白的结合常数，实验无需分离步骤，适合高通量筛选。

案例 4：酶动力学分析

动力学模式实时监控酶促反应吸光度变化，计算 Vmax 与 Km 值，用于酶活性评价。

八、总结

Varioskan Flash 的多检测模式设计，使其既能胜任常规吸光度测定，也能在荧光、发光、时间分辨等高灵敏度领域发挥优势。单色仪的灵活波长选择和多模式组合检测能力，为科研人员提供了从方法开发到高通量检测的完整解决方案。
合理选择检测模式并针对实验优化参数，可以显著提升数据质量、缩短实验周期，并拓展仪器的应用范围。