赛默飞分光光度计 Evolution One 样品准备详解

一、前言

分光光度法是一种基于物质对特定波长光的吸收特性进行分析的常用方法，广泛应用于分子生物学、环境科学、药物研发、食品检测和临床医学等领域。赛默飞 Evolution One 分光光度计凭借宽波长覆盖、高精度和多模式检测功能，为科研人员提供了可靠的实验平台。然而，样品准备是确保实验准确性和可重复性的关键步骤。如果样品前处理不当，即使仪器性能再先进，也难以得到可靠的数据。

本文将深入解析在使用赛默飞 Evolution One 分光光度计时，样品准备的基本原则、不同类别样品的处理方法、操作中的注意事项，以及常见问题与解决策略。

二、样品准备的重要性

1. 保证测定准确性

• 样品浓度过高或过低均会导致吸光度偏差。

• 杂质或沉淀物会干扰光路，影响透光率。

2. 提升结果重复性

• 标准化的样品准备方法能够减少操作误差，保证不同批次实验结果一致。

3. 减少仪器负担

• 清洁的样品能够延长比色皿寿命，降低光学系统的污染风险。

4. 满足特定实验需求

• 不同实验目标需要不同的样品制备方式，例如核酸检测需要避免蛋白质污染，蛋白质定量则需合适的缓冲液环境。

三、常见样品类型与准备方法

1. 核酸样品

• 提取与纯化
  使用商业化试剂盒或经典酚/氯仿法提取核酸，确保去除蛋白质和多糖。

• 浓度范围
  DNA/RNA 样品的理想浓度一般在 20–200 ng/μL。

• 检测要点

• 使用 260 nm 波长检测核酸浓度。

• 计算 260/280 比值，用于评估纯度。理想比值为 1.8–2.0。

• 注意事项

• 样品应无气泡，避免光程干扰。

• 使用低吸附离心管保存，减少降解。

2. 蛋白质样品

• 制备方法
  常用缓冲液溶解蛋白质，避免使用强吸光物质（如高浓度 Tris、咪唑）。

• 检测模式

• 280 nm 波长直接检测芳香族氨基酸吸收。

• Bradford、BCA 等比色法可通过显色反应增强灵敏度。

• 注意事项

• Bradford 法需制备标准曲线。

• 避免样品浑浊，否则需离心去除沉淀。

3. 小分子与化合物样品

• 溶解与稀释

• 使用适宜的有机溶剂或缓冲液，保证样品完全溶解。

• 避免溶剂本身在目标波长范围内有强吸收。

• 浓度控制

• 样品浓度应使吸光度落在 0.1–1.0 范围内，保证线性。

4. 环境与食品样品

• 预处理

• 水样需过滤或离心去除悬浮颗粒。

• 食品样品需提取目标成分，并进行稀释或净化。

• 常用检测

• 水中硝酸盐、磷酸盐通过比色试剂反应显色后检测。

• 食品色素或添加剂直接溶解提取后检测。

5. 临床样品

• 血清与血浆

• 需离心去除细胞成分，避免血红蛋白干扰。

• 在 -20℃ 或 -80℃ 下保存，避免降解。

• 药物检测

• 样品常需蛋白沉淀、提取或稀释，以适应测定波长范围。

四、比色皿与样品容器准备

1. 比色皿类型选择

• 石英比色皿：适用于 190–1100 nm，全波段分析必备。

• 光学玻璃比色皿：适合 320 nm 以上的检测。

• 微量比色皿：适合微量样品，降低消耗。

2. 比色皿清洁

• 每次使用前后需清洗干净，并用无水乙醇冲洗、晾干。

• 禁止用硬物刮擦，避免光学面损伤。

3. 样品体积要求

• 标准比色皿一般需要 1–3 mL 样品。

• 微量比色皿最低仅需 1–5 μL。

五、操作中的注意事项

1. 样品均一性

• 测定前需充分混匀，避免浓度梯度。

• 高粘度样品需适当稀释。

2. 避免气泡干扰

• 上样时操作轻柔，必要时可轻敲比色皿去除气泡。

3. 背景对照

• 使用溶剂或缓冲液作为参比，确保扣除背景吸收。

4. 样品保存

• 实验中未用的样品应置于冰上或恒温条件下保存。

• 长期存放需冷冻保存，避免反复冻融。

六、常见问题与解决策略

1. 吸光度过高

• 可能因样品浓度过高，需进一步稀释。

• 检查是否存在杂质或浑浊。

2. 基线漂移

• 检查比色皿是否清洁。

• 确认参比液是否与样品溶剂一致。

3. 重复性差

• 样品未充分混匀或比色皿残留物干扰。

• 建议使用移液器准确移取。

4. 光谱异常峰

• 可能是杂质引起，需重新纯化样品。

• 检查溶剂在目标波长下是否有强吸收。

七、优化样品准备的策略

1. 标准化操作流程

• 建立实验 SOP（标准操作程序），统一样品浓度范围、处理步骤和保存条件。

2. 优化缓冲体系

• 避免使用在目标波长下吸收明显的组分，如高浓度盐类或强还原剂。

3. 引入质控样品

• 在每次实验中设置标准样品或对照，确保数据可比性。

4. 批量处理与自动化

• 使用自动化移液系统或比色皿架，提高大规模样品制备效率。

八、案例分析

1. 核酸检测实验

• 某实验室在测定 RNA 时，因样品中残留酚类杂质导致 230 nm 波长吸收偏高。通过增加乙醇沉淀步骤去除杂质后，260/280 比值恢复正常，结果更加可靠。

2. 蛋白质定量实验

• 在 Bradford 法检测中，研究人员未充分混匀导致显色不均。改进后使用涡旋混匀，标准曲线线性度明显提高。

3. 环境水样检测

• 测定水中硝酸盐时，因未及时过滤导致悬浮物干扰。通过 0.22 μm 滤膜过滤后，吸光度曲线更加平滑，检测精度提升。

九、未来样品准备的发展趋势

1. 微量化与高通量

• 样品准备将向低体积、自动化方向发展，以适应高通量检测需求。

2. 集成化系统

• 未来可能将提取、纯化与上机检测整合为一体化平台，减少人工误差。

3. 智能化控制

• 样品浓度检测、稀释和加样有望由 AI 算法辅助完成，提高效率和准确性。

4. 绿色化学与可持续

• 样品制备过程将逐步减少有害溶剂使用，推动环保实验方案。

十、结语

在分光光度分析中，样品准备是决定实验成功与否的关键环节。赛默飞 Evolution One 分光光度计虽具备高精度和多功能，但若样品前处理不当，依然可能导致结果误差。通过规范化操作、合理选择溶剂和比色皿、避免杂质干扰、严格对照设置，科研人员能够大幅提升实验数据的可靠性与重复性。