赛默飞分光光度计NanoDrop Eight样品浓度测定详解

一、NanoDrop Eight概述

赛默飞NanoDrop Eight是NanoDrop系列的多通道微量分光光度计，专门用于核酸、蛋白及其他生物样品的定量分析。与传统比色皿方式不同，NanoDrop Eight采用微量上样平台设计，样品体积仅需1~2 µL即可完成浓度测定。其优势在于：

1. 高灵敏度与高重复性；

2. 多通道设计，一次可同时检测多达8个样品；

3. 无需比色皿和耗材，降低实验成本；

4. 内置软件能自动计算浓度并提供纯度比值。

NanoDrop Eight覆盖190~850 nm波长范围，能够完成核酸、蛋白、多肽、寡核苷酸以及色素等样品的快速定量，适合高通量分子生物学实验室使用。

二、样品浓度测量的基本原理

NanoDrop Eight的核心原理仍然基于比尔-朗伯定律：

$$A=\epsilon \cdot c\cdot l$$

其中：

• $A$ 为吸光度（Absorbance）；

• $\epsilon$ 为摩尔消光系数；

• $c$ 为样品浓度；

• $l$ 为光程。

NanoDrop Eight的特殊之处在于其采用自动调节光程技术。常见光程为1 mm和0.2 mm，仪器会根据样品浓度自动切换，以保证结果落在检测线性范围内。相比传统1 cm光程的比色皿，NanoDrop的短光程设计大大拓宽了样品浓度检测范围，可覆盖0.2~2500 ng/µL的DNA浓度。

三、样品浓度测量流程

1. 仪器启动与初始化

• 打开NanoDrop Eight电源并启动软件。

• 选择检测类型（如核酸、蛋白、荧光标记分子等）。

• 进行光源预热，确保检测基线稳定。

2. 空白校正

• 使用与样品相同的溶剂（如超纯水、TE缓冲液、PBS等）。

• 在检测孔中滴加1.5 µL溶剂，点击“Blank”，完成基线扣除。

3. 样品加载

• 将待测样品1.5 µL加载至检测孔。

• 仪器自动检测光强并调节光程。

• 测定完成后，擦拭检测窗口，避免交叉污染。

4. 数据读取

• 软件界面直接显示吸光度值、浓度值和纯度比值。

• 支持结果导出为Excel或LIMS数据库。

四、不同分子类型的浓度测定

1. 核酸样品

核酸在260 nm处具有最大吸收峰，其浓度可直接通过A260值计算：

• dsDNA（双链DNA）：1 A260 = 50 ng/µL

• ssDNA（单链DNA）：1 A260 = 33 ng/µL

• RNA：1 A260 = 40 ng/µL

• 寡核苷酸：需根据序列计算摩尔消光系数

纯度判定：

• A260/A280 比值：1.8~2.0为纯净核酸，低于此值提示蛋白污染

• A260/A230 比值：>2.0为理想值，偏低提示有机溶剂或盐类残留

2. 蛋白样品

蛋白质在280 nm有特征吸收峰，主要来源于芳香族氨基酸（Trp、Tyr、Phe）。

• 直接法：A280检测，需输入摩尔消光系数或假设1 A280 = 1 mg/mL（适用于部分蛋白）。

• 染料法：Bradford法（595 nm）、BCA法（562 nm），通过标准曲线计算浓度。

纯度判定：

• 蛋白样品常结合光谱扫描确认是否存在核酸或其他色素干扰。

3. 其他样品类型

• 多肽与合成分子：需根据序列或化学结构计算理论消光系数。

• 色素与小分子：通过光谱扫描确定最大吸收峰，再建立标准曲线进行浓度换算。

五、实验案例解析

案例1：基因组DNA提取检测

• 测量波长：260 nm

• 结果：A260=0.25 → DNA浓度 = 12.5 ng/µL

• 纯度比值：A260/A280=1.85，A260/A230=2.05 → 表明DNA较为纯净，可用于PCR扩增。

案例2：RNA检测

• 测量波长：260 nm

• 结果：A260=0.4 → RNA浓度 = 16 ng/µL

• 纯度比值：A260/A280=1.95，A260/A230=1.5 → 存在盐类或酚残留，需进一步纯化。

案例3：重组蛋白浓度测定

• 测量波长：280 nm

• 结果：A280=0.7，输入摩尔消光系数后计算浓度 = 0.9 mg/mL

• 光谱扫描无核酸污染峰，结果可靠。

六、结果解读与数据处理

1. 浓度结果：NanoDrop软件直接给出数值，用户可导出用于实验设计。

2. 纯度比值：是判定实验材料是否可用于下游实验的重要指标。

3. 光谱曲线：通过扫描可发现异常吸收峰，帮助判断杂质来源。

4. 批量数据分析：NanoDrop Eight可同时检测8个样品，软件支持数据统计与对比。

七、常见问题与优化策略

1. 浓度结果偏低

• 原因：样品降解、光程不稳定、上样不足

• 优化：检查样品完整性，确保上样体积准确，使用校正后的移液器

2. A260/A280比值过低

• 原因：蛋白残留

• 优化：再次纯化样品，如使用柱式纯化或酚氯仿抽提

3. A260/A230比值过低

• 原因：盐类或有机物残留

• 优化：乙醇沉淀或二次洗涤

4. 不同通道结果差异大

• 原因：检测窗口未清洁，交叉污染

• 优化：每次测量后及时用无绒纸巾擦拭窗口

5. 高浓度样品超出检测范围

• 原因：光程过短仍超范围

• 优化：稀释样品，重新检测

八、总结

赛默飞NanoDrop Eight分光光度计凭借微量上样、多通道并行和自动光程调节技术，极大地提升了核酸、蛋白及多种生物分子的浓度检测效率。其结果解读不仅依赖于吸光度转化的浓度值，还需要结合纯度比值和光谱扫描综合判断。

正确的样品处理、合理的空白校正和规范的操作步骤，能够确保实验结果的准确性与重复性。对于分子生物学研究而言，NanoDrop Eight提供的浓度与纯度数据是后续PCR扩增、测序、蛋白质表达等实验能否顺利进行的前提保障。

通过科学使用NanoDrop Eight，研究人员能够在最小样品消耗的前提下，快速获得可靠的定量信息，从而大幅度提升实验室工作效率与研究质量。