赛默飞分光光度计NanoDrop Eight蛋白检测

一、前言

蛋白质定量是分子生物学、医学、药学和生物工程领域实验的基础环节。无论是进行电泳、免疫印迹，还是进行酶学分析与质谱检测，准确测定蛋白浓度与纯度都是关键步骤。赛默飞NanoDrop Eight分光光度计凭借高通量检测能力、极低样品用量及宽广的光谱范围，成为实验室蛋白检测的常用工具。

本篇将系统介绍NanoDrop Eight在蛋白检测中的应用，从基本原理到操作方法，再到数据解读与实验经验，全面呈现其优势与实践要点。

二、蛋白检测的原理

1. 紫外吸收法

蛋白质中含有芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸），其在280 nm处有明显吸收峰。通过测定280 nm处的吸光度即可估算蛋白浓度。该方法简便快捷，但要求样品较为纯净，且需预先知道摩尔消光系数。

2. 肽键吸收法

在190~230 nm区间，蛋白质肽键会产生强吸收峰。NanoDrop Eight的光谱范围覆盖190 nm，因此可以通过检测低波长区域吸收来辅助评估蛋白浓度。

3. 染料结合法

当样品复杂、含有杂质或缓冲液对280 nm检测有干扰时，常采用染料法。不同方法的检测波长如下：

• Bradford法：595 nm

• BCA法：562 nm

• Lowry法：750 nm
  NanoDrop Eight能够在全光谱范围内检测，因此适用于上述各种方法。

三、实验前准备

1. 仪器准备

• 将NanoDrop Eight置于稳定的实验台，避免震动干扰。

• 开机预热3~5分钟，确保光源稳定。

• 检查检测平台，确认无残留或污染。

2. 样品准备

• 缓冲液选择：尽量使用对紫外吸收影响小的缓冲体系，如PBS或Tris。避免高浓度去污剂和有机溶剂。

• 样品浓度：保证浓度在仪器的检测范围内，过高需稀释，过低可能信噪比不足。

• 混匀处理：确保溶液均一，避免沉淀或气泡。

3. 空白对照

• 使用与样品相同的缓冲液作为空白，进行基线校正。

• 不同检测方法需选用相应的空白溶液。

四、蛋白检测的操作步骤

1. 上样

• 使用移液器准确取1.5~2 μL样品，滴加在检测平台中央。

• 避免产生气泡，确保液滴均匀覆盖光路。

• 关闭样品臂，立即开始测定。

2. 模式选择

• Protein A280模式：快速检测纯蛋白浓度。

• Protein A205模式：基于肽键吸收的检测方法。

• Protein BCA/Bradford模式：适用于复杂样品和需要染料的检测。

• 全光谱扫描：用于评估蛋白样品的整体吸收特征。

3. 测定流程

• 先测空白对照，建立基线。

• 依次测定各样品，系统可同时检测8个通道，提高效率。

• 每次检测后，仪器会自动输出浓度、纯度及光谱曲线。

五、数据解读

1. A280直接法结果

• 测得吸光度值后，结合摩尔消光系数计算蛋白浓度。

• 该方法适合高纯度蛋白样品，如纯化后的重组蛋白。

2. A205法结果

• 因肽键普遍存在，该方法对所有蛋白普适，但背景干扰较大。

• 适用于无法使用A280的样品。

3. 染料法结果

• 仪器会根据标准曲线自动换算样品浓度。

• Bradford法灵敏度较高，适合低浓度蛋白检测。

• BCA法抗干扰性强，更适合含有去污剂或盐的样品。

4. 光谱曲线

• 280 nm处有明显峰值，说明蛋白浓度较高。

• 230 nm峰值过高可能提示有机物或缓冲盐污染。

• 若在260 nm有峰值，需考虑是否存在核酸污染。

六、常见问题与解决方法

1. 吸光度过高

• 原因：蛋白浓度过高，超出检测范围。

• 解决：对样品进行适当稀释。

2. 吸收比值异常

• 问题：蛋白样品在260 nm处吸收强烈，A260/A280比值过高。

• 原因：核酸污染。

• 解决：对样品进行核酸去除处理。

3. 光谱曲线异常

• 问题：出现锯齿或噪音过大。

• 原因：样品体积不足、气泡或平台未清洁。

• 解决：重新加样并清洁平台。

4. 重复性差

• 问题：同一样品多次测定结果差异大。

• 原因：移液操作不规范或平台残留。

• 解决：保持一致的上样操作，每次检测后及时清洁。

七、实验经验总结

1. 样品处理经验

• 蛋白浓度过低时，建议使用Bradford或BCA方法。

• 高盐或含有还原剂的缓冲液对紫外检测干扰明显，应提前稀释或更换缓冲液。

2. 数据解读经验

• 仅依赖280 nm单点结果可能导致误差，建议结合全光谱扫描曲线判断样品质量。

• 对科研论文或报告，应保存完整光谱数据，而不仅仅是浓度值。

3. 操作规范经验

• 样品体积需严格一致，避免因液滴大小差异导致误差。

• 建议在实验室建立统一的SOP流程，尤其是对多用户实验室。

4. 高通量检测经验

• NanoDrop Eight的8通道设计非常适合批量蛋白检测，可大幅缩短实验时间。

• 配合自动化移液器使用时效率更高。

八、维护与保养

1. 平台清洁

• 每次检测后用无核酸酶水或70%乙醇擦拭平台。

• 避免残留样品干固在检测窗口。

2. 光源检查

• 长时间使用后若发现光谱偏移或数据不稳定，应联系厂家维护。

3. 软件管理

• 定期更新检测软件，保证数据处理功能稳定。

• 实验室应建立数据归档制度，统一保存结果。

九、应用案例

1. 蛋白纯化后的浓度测定

利用A280法快速检测目标蛋白浓度，结合纯度分析判断样品是否可用于下游实验。

2. 免疫学实验准备

在进行ELISA、WB实验前，使用Bradford法定量蛋白，确保上样量一致。

3. 酶学实验

使用BCA法测定酶蛋白浓度，再配合动力学实验评估酶活性。

4. 药物研发

检测重组蛋白或抗体样品的浓度和纯度，保证药效评价实验的准确性。

十、总结

NanoDrop Eight分光光度计为蛋白检测提供了快速、准确、灵敏的解决方案。其优势不仅在于所需样品体积极少，还在于能同时完成多通道检测，大幅提升实验效率。在具体应用中，应根据样品性质选择合适的检测模式，合理解读光谱数据，并保持良好的实验习惯。通过积累经验和优化流程，研究人员可以更好地发挥NanoDrop Eight的性能，获得高质量的实验数据。