一、校准的必要性与核心目标

1. 为什么要校准 IX-70？

• 保证显微成像的清晰度与对比度；

• 确保多通道荧光图像的光轴一致性；

• 避免图像位置漂移或误差叠加；

• 提升图像定量分析的精确性；

• 实现与图像采集软件的参数匹配；

• 确保机械部件（如电动平台、Z轴）重复定位性能优良。

2. 校准频率建议

二、光学系统校准

1. 光轴与成像中心调整

• 工具：十字刻线标本、光靶板；

• 方法：

1. 安装10×物镜；

2. 在明场下对准刻线中心；

3. 切换至相机通道，调节中继镜头或光路调节螺丝使图像中心与光轴重合；

4. 确保旋转物镜后，中心位置偏差不超过10 μm。

2. 视场光栏与孔径光栏校准

• 目的：调整视场亮度与对比度均匀性；

• 操作步骤：

• 全部打开光栏；

• 聚焦样本后逐步关闭孔径光栏至图像边缘清晰；

• 调节视场光栏大小，使其边缘刚好在视野边界内。

三、荧光通道校准

1. 通道中心对齐（Chromatic Shift Calibration）

• 问题表现：DAPI、FITC、TRITC等通道图像在多色合成时存在偏移；

• 解决方法：

1. 使用多色荧光微球（如TetraSpeck）；

2. 拍摄各通道图像；

3. 在图像软件中测量微球中心坐标；

4. 调整滤光片转轮、荧光立方体位置，直至误差小于0.5 μm；

5. 或使用软件“通道对齐”功能进行数字补偿。

2. 荧光亮度平衡与光源中心调整

• 光源偏心会造成照明不均、背景高低不一；

• 校准流程：

• 拆卸荧光灯室前端，调整灯泡位置与聚光镜位置；

• 使用荧光亮度均匀片观察照度分布；

• 直至整个视场照明均匀，中心亮度一致。

四、聚焦系统校准

1. Z轴行程线性与重复精度检测

• 测试工具：标准厚度玻片、Z轴微动测试片；

• 操作方法：

• 启用电动Z轴；

• 设定起始位置并逐层扫描样本；

• 在多个回合中返回同一层面，记录聚焦偏差；

• 偏差应小于0.5 μm。

2. 自动聚焦模块调校

• 如果配有AF（Auto Focus）模块，应进行：

• 起始位置对焦精度校正；

• 回调参数设置；

• 与图像采集软件进行同步测试。

五、电动平台与XY定位系统校准

1. 移动精度与重复定位测试

• 工具：格点校准片、坐标测试软件；

• 方法：

• 在XY轴方向按设定路径移动；

• 拍摄各格点图像并比对图像坐标；

• 定位偏差应小于2 μm；

• 如果超出标准，可重新标定坐标系统或调整驱动器齿轮系统。

2. 平台水平度检查

• 工具：水平尺；

• 方法：放置在平台四角与中心位置检查；

• 若存在不平，应调整平台固定螺丝或更换平台支架垫片。

六、图像采集系统与软件校准

1. 白平衡与色彩校正

• 使用标准白平衡校准板，在明场和荧光模式下校准相机；

• 调节R、G、B通道增益系数，确保图像色彩真实无偏色。

2. 曝光时间与增益设定

• 每种染料或观察模式应单独设定曝光时间；

• 自动曝光应与手动曝光结果对比，防止过曝或欠曝。

3. 时间序列同步测试

• 配合软件设置拍照间隔、焦点保持与Z-stack扫描；

• 确保在多时间点图像中样本位置稳定；

• 检查是否出现光源滞后或拍照延迟现象。

七、成像接口与中继镜校准

1. 成像倍数匹配检测

• 使用刻度标尺图像测试；

• 根据物镜放大倍率与传感器尺寸确认中继镜头倍率是否合理；

• 确保实际成像倍数与理论匹配，避免尺寸误差。

2. 成像清晰度测试

• 中继镜若角度不当或镜片偏心，会导致图像模糊或边缘不清；

• 需调节接口位置，优化与相机光轴匹配。

八、常见校准异常及处理建议

九、系统校准建议流程图（文字描述）

1. 设备开机预热15分钟 →

2. 目镜与成像光轴校准 →

3. 平台移动精度检测与归零设置 →

4. Z轴聚焦范围与重复性测试 →

5. 荧光通道顺序对位与亮度调节 →

6. 成像接口与中继镜头调焦 →

7. 相机图像参数调节与白平衡校准 →

8. 保存设置参数 / 配置文件备份

十、总结与维护建议

奥林巴斯IX-70作为一套多功能倒置显微成像平台，其系统性能是否稳定在很大程度上依赖于定期科学的校准操作。完整的系统校准流程不仅能提升图像质量、提升实验效率，还能延长设备的使用寿命，保障科研图像结果的可重复性。

建议建立如下制度：

• 设立“显微镜定期校准记录表”；

• 每次校准后保存设置参数文件；

• 关键部件（滤光片组、电动部件）建立独立巡检机制；

• 实验室负责人每季度审核设备性能与图像样张。