一、环境与设备开机准备

1. 实验环境检查

• 确保显微镜放置在平整、防震的实验台面上；

• 保持周围空间至少留出30厘米，以便操作与散热；

• 温度控制在20–25℃、相对湿度不超过60%。

2. 电源与稳压

• 接通独立电源插座，推荐使用稳压器或不间断电源（UPS）；

• 确认主机后部电源开关处于“关”状态，再插入电源线。

3. 系统预热

• 打开主机电源开关，启动后等待约10分钟预热；

• 卤素灯或荧光灯模块预热过程中，不可进行拍摄或切换操作；

• 目镜、物镜、载物平台等部件预热后达到稳定状态。

二、光学路径与照明系统校正

1. 物镜清洁与就位

• 取下并用镜头纸轻拭物镜前端，避免灰尘与指纹；

• 按顺序将所需物镜（如10×、20×、40×）安装于物镜转盘，确保卡扣到位。

2. 聚光器与光栏调节

• 明场观察：旋动聚光器使光斑覆盖整个视野；

• 调整视场光栏（Field Diaphragm）大小至刚好超出视野边缘，然后缓慢打开至最佳对比；

• 调整孔径光栏（Aperture Diaphragm）至0.7–0.8 NA，以平衡分辨率与对比度。

3. 荧光光源校准（如需）

• 切换到荧光观察模块，确认滤光片座中各滤光片位置正确；

• 打开荧光灯模块，待灯丝稳定后，通过调整聚光镜位置使照明均匀，无明显中心过曝。

三、观察模式切换与物镜对位

1. 明场／相衬切换

• 明场模式：无需安装相衬环，聚光器使用光栏模式；

• 相衬模式：安装相衬环片与对应的相衬物镜，将聚光器换为相衬聚光片，并精调环位对中。

2. 荧光通道切换

• 轻按滤光片切换按钮，将不同激发/发射滤片转入光路；

• 每次切换后应进行样本预览，避免滤片损伤或位置偏移。

3. DIC／偏振切换（如需）

• 安装 DIC 偏光器与棱镜系统，调整偏光片角度至最优对比；

• 偏振模式：安装偏振片，旋转至样本最强双折体验收位置。

四、样本准备与装载

1. 培养皿／多孔板

• 贴壁样本：将培养皿置于载物台中心夹具中，旋紧固定；

• 多孔板：选用多孔板适配器，确保各孔对准载物台缺口。

2. 玻片／玻底皿

• 玻片：将玻片夹于载物台两侧定位槽，使用压片器压平；

• 玻底皿：利用专用支架或环卡牢固，避免晃动。

3. 微流控芯片／其他特殊定制

• 将芯片装夹于夹具，确保液面与物镜工作距离匹配；

• 如需温控或 CO₂ 培养，连接相应配件与外部控制器。

五、聚焦与视野定位

1. 低倍预览聚焦

• 使用 4× 或 10× 物镜进行粗聚焦；

• 调节载物台至最大高度，逐步向下旋调焦轮，直至视野出现样本轮廓。

2. 逐级放大与微调

• 切换至更高倍（20×、40×）前，先进行粗焦微调；

• 切换后再微动调焦至图像清晰，避免物镜与样本撞击。

3. 光路分光比例调整

• 在三目筒上设置分光比（100:0、80:20、0:100）以决定目镜与相机光路；

• 拍摄前将光路切换至 0:100，确保全部光线进入相机。

六、图像采集与参数设定

1. 相机连接与初始化

• 将 C-mount 接口与相机对齐，旋紧保证光轴一致；

• 打开采集软件（CellSens、MetaMorph 等），加载相机驱动。

2. 曝光与增益调节

• 初次预览时设低增益、较长曝光；

• 根据亮度调整增益与曝光时间，确保图像不过曝不过暗。

3. 白平衡与色彩校准

• 明场：使用白纸或空白区域设定白平衡；

• 荧光：通过无样本背景或荧光标准片进行灰阶及通道校正。

4. 时间序列与 Z-stack 设置（如需）

• 在软件中设定时间间隔、帧数及 Z 轴步长；

• 确保自动聚焦或保留最佳焦点，完成多通道或层扫描。

5. 图像保存与命名规范

• 保存为 TIFF（无损）或原始格式；

• 文件命名中包含样本编号、日期、放大倍数、通道信息。

七、实验结束与设备关机

1. 光源关闭

• 先关闭荧光灯或卤素灯，待灯丝冷却后关闭主机电源；

• 避免频繁开关对灯泡寿命造成影响。

2. 物镜与目镜保护

• 在物镜转盘位置留空位（4×或较低倍物镜）以方便下次预览；

• 用防尘罩覆盖镜筒和物镜，防止灰尘堆积。

3. 软件关闭与数据备份

• 退出采集软件并断开相机连接；

• 及时备份图像数据至实验室服务器或外部存储。

八、日常维护与保养要点

1. 光学部件清洁

• 定期使用镜头纸和镜头清洁液擦拭物镜、目镜、滤光片；

• 切勿使用含酒精的清洁剂直接喷洒于镜头表面。

2. 机械件润滑

• 每半年检查载物台滑轨、聚焦丝杆，如有干涩现象添加厂商推荐润滑油；

• 避免过度润滑导致灰尘粘附。

3. 电气与软件更新

• 定期检查相机与采集软件更新、固件版本，确保兼容性；

• 记录校准参数并留存历史记录，便于追溯与维护。

4. 灯源更换周期

• 荧光灯（汞灯/金属卤素）使用寿命一般为500–1000小时，应按使用记录及时更换；

• LED 光源寿命较长，但也需关注亮度下降，必要时更换模块。

九、常见问题与故障排查

十、操作流程总结与建议

1. 按步骤执行：严格按照“预热→校准→装样→观察→拍摄→关机→保养”流程进行，避免遗漏关键环节。

2. 做好记录：每次实验前后填写仪器运行与样本使用日志，便于追踪与维护。

3. 培训与交接：新用户必须在有经验同事指导下操作，确保基本功熟练后方可单独使用。

4. 定期校准：建立定期校准制度，包括光路校准、聚焦精度、荧光通道对位等，保持设备长期稳定。