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一、实验原理概述

伯乐（Bio-Rad）电穿孔仪165-2660是一种利用瞬间高压脉冲在细胞膜上产生可逆性孔洞，从而使外源DNA、RNA或蛋白质进入细胞的转化设备。该仪器通过精确的电场控制，使细胞膜结构短暂改变并在脉冲结束后迅速修复，从而在保持细胞活性的前提下实现高效导入外源物质。电穿孔技术在分子克隆、基因编辑、疫苗研究以及细胞工程等领域有着广泛应用。

其工作原理基于电场诱导极化效应：当电压施加于细胞悬液时，细胞膜两侧形成电位差；当电场强度达到临界值时，磷脂双层发生局部重排形成微孔；外源分子通过这些孔洞进入细胞内部。电场撤除后，膜结构自动修复，外源基因得以稳定存在或表达。

165-2660电穿孔仪配备自动时间常数测量系统、精密电容调节模块和多模式脉冲输出功能，能够针对不同细胞类型进行精确参数匹配，从而获得最优转化效果。

二、实验准备阶段

1. 仪器准备

在正式操作前，应对电穿孔仪进行检查和校准：

• 确认电源稳定在220V±10%，避免电压波动影响输出精度。

• 检查电极槽与连接线是否完好无损，无腐蚀或松动。

• 确认安全盖功能正常，盖合后系统应显示“Ready”状态。

• 检查显示屏是否正常显示电压、电容及时间常数。

• 如需多次重复实验，建议提前设定并保存参数程序，以提高操作效率。

2. 试剂与材料准备

• 目标细胞（如大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞）

• 电穿孔缓冲液（无离子、低导电性）

• 外源DNA、RNA或质粒溶液（浓度应在10–100 ng/µL）

• 电转杯（间隙0.1 cm、0.2 cm或0.4 cm）

• 复苏培养基与适配抗生素平板

3. 样品预处理

细胞的生理状态对电穿孔成功率影响显著。一般原则如下：

• 细菌：应处于对数生长期，OD600值约为0.5–0.8。

• 真核细胞：应保持高活性，无凋亡或污染。

• 植物原生质体：需新鲜制备，并悬浮于渗透稳定溶液中。

样品离心后用无盐缓冲液反复洗涤3–4次，以去除残余离子。最后悬浮于少量电转缓冲液中，浓度以1×10⁸细胞/mL为宜。

三、实验操作流程

1. 参数设定

根据细胞类型选择适当参数。165-2660具备电压、电容、电阻及脉冲次数可调功能，实验者可在显示界面上逐步输入设定值。以下为常用参数参考范围：

设定完成后，设备将自动检测电路状态并显示“Ready”。若出现“Check Cuvette”提示，需重新插入电转杯或检查接触点。

2. 样品装填

取适量处理好的细胞悬液（约50–100 µL），加入等体积的DNA溶液，轻轻混匀后转移至电转杯中。应避免气泡存在，因为气泡会导致电弧放电，损坏样品并影响实验结果。

在操作过程中，应确保电转杯温度较低。可在冰上短暂放置以减少热效应，但不可冻结。

3. 放电操作

将电转杯置入电穿孔仪槽位，确保两侧接触紧密。关闭安全盖后，按下启动键。仪器将在瞬间输出设定电压并自动显示时间常数。整个放电过程持续时间极短，通常为几毫秒。

若显示屏提示“ARC DETECTED”，说明放电不均或液体导电性过高，应重新更换缓冲液并降低电压。

4. 复苏步骤

放电结束后立即使用无菌移液枪将样品吸出，加入至含复苏培养基的离心管中。

• 对于细菌样品：在37°C摇床中复苏45–60分钟；

• 对于真核细胞：可静置培养2–4小时后换液；

• 对于植物原生质体：放入等渗培养液中静置12小时。

复苏期间细胞膜逐渐修复，外源分子得以稳定保留。此步骤直接影响转化效率与细胞存活率。

四、实验优化与数据分析

1. 参数优化策略

在初次实验时，建议以较低电压起始，逐步增加以确定最佳点。记录每次实验的电压、电容与时间常数，并对转化效率进行统计。常见优化方向如下：

• 若转化效率低：可适度提高电场强度或延长脉冲时间。

• 若出现明显电弧：降低电压或更换更纯净的缓冲液。

• 若细胞死亡率高：缩短脉冲时间或降低脉冲次数。

2. 时间常数判断

理想的时间常数表示能量释放均匀且细胞未受损。对于细菌实验，4–5 ms最为理想；真核细胞通常在8–10 ms范围效果最佳。若时间常数过低，说明电场未充分作用；若过高，说明液体电阻过大或细胞浓度不合适。

3. 转化效率评估

通过涂布含选择标记的平板或荧光检测评估转化成功率。可采用以下公式计算：
转化效率=阳性克隆数输入DNA量（µg）×109转化效率 = \frac{阳性克隆数}{输入DNA量（µg）} \times 10^9转化效率=输入DNA量（µg）阳性克隆数×109
将实验组与对照组对比，确定最佳条件组合。

五、典型实验实例

实例一：大肠杆菌质粒转化

1. 取感受态细胞80 µL与质粒溶液5 µL混合。

2. 使用0.2 cm电转杯，设定电压2.5 kV、电容25 µF。

3. 放电后立即加入1 mL SOC培养基。

4. 37°C复苏1小时后涂布含抗生素平板。

5. 过夜培养后统计阳性克隆数量。

结果显示转化效率稳定在1×10⁹ CFU/µg DNA。

实例二：HEK293细胞mRNA转染

1. 将细胞离心后悬浮于无钙镁缓冲液中。

2. 加入100 µg/mL的mRNA溶液。

3. 使用0.4 cm电转杯，设定电压0.45 kV，电容250 µF，双脉冲间隔100 ms。

4. 放电后转入培养皿，静置30分钟后换液。

5. 24小时后检测表达蛋白水平。

该方法能显著提高转染效率且细胞活性保持良好。

六、实验注意事项

1. 避免电弧放电：所有液体必须使用高纯水或专用缓冲液配制。

2. 样品体积：电转杯液体体积不宜超过推荐容量的85%。

3. 温度控制：高温会增加细胞死亡率，建议全程在低温环境操作。

4. 重复实验：每批次实验应至少重复三次，以验证结果可靠性。

5. 安全防护：操作高压设备时应佩戴防护手套，确保安全盖完全闭合。

七、常见问题与解决方案

八、数据记录与报告撰写

每次实验后应完整记录以下信息：

• 电压、电容、时间常数、脉冲次数；

• 样品类型、DNA浓度、体积及批次；

• 实际观察到的转化效率与细胞状态；

• 任何异常现象（如电弧、温升、气泡等）。

通过建立实验数据库，可在长期积累中获得最优参数曲线，为不同细胞类型提供精准参考。

九、实验结束与设备维护

1. 放电结束后等待约30秒，使内部电容自动放电完毕。

2. 拔出电转杯，用无离子水清洗并晾干。

3. 使用干净棉布擦拭仪器外壳，保持干燥。

4. 每隔3–6个月进行一次校准检查，确保输出稳定。

5. 若长时间不使用，应断电并覆盖防尘罩，存放于阴凉干燥处。