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一、概述

伯乐电穿孔仪 165-2660 是一款高精度的基因导入设备，能够在极短时间内释放高压脉冲，使细胞膜产生瞬时可逆性微孔，从而实现外源 DNA、RNA 或蛋白质分子的进入。
电击条件是决定实验成功率的关键因素，它直接影响细胞膜通透性、导入效率和存活率。

科学合理地设定电击条件，需要综合考虑电压、电场强度、脉冲时间、脉冲次数、电击杯间隙、样品电阻、缓冲液成分等多项参数。
本章将对伯乐电穿孔仪 165-2660 的电击条件进行系统说明，并结合不同细胞类型提供详细的参数建议与优化方案。

二、电击条件的定义

“电击条件”是指在电穿孔实验中，伯乐电穿孔仪所施加的电场参数与实验物理环境的综合组合。
它包含以下关键要素：

1. 电压（Voltage, V）：控制电场强度，是决定膜孔形成的主要驱动力。

2. 电击杯间隙（Cuvette Gap, cm）：电极之间的距离，影响电场分布与电流密度。

3. 电场强度（Electric Field Strength, kV/cm）：由电压与间隙决定的实际电场强度。

4. 电容与电阻：决定能量释放速率及波形衰减方式。

5. 脉冲时间与次数：决定电场作用时间与累积能量。

6. 波形类型：指数衰减波或方波，影响电场的时间分布特性。

7. 样品导电性与体积：由缓冲液成分与细胞浓度决定。

合理配置这些参数，能够在不破坏细胞活性的前提下实现高效分子导入。

三、电击条件的物理基础

当高压脉冲作用于细胞悬液时，细胞膜两侧形成瞬间电位差。当该电位差超过膜介电强度时，膜表面出现纳米级孔洞。

电场强度计算公式：

E=VdE = \frac{V}{d}E=dV

其中：

• E 为电场强度（kV/cm）

• V 为电压（V）

• d 为电极间距（cm）

电场强度过低则无法形成足够数量的微孔，导入率低；
过高则造成膜永久性破裂，细胞死亡率增加。

四、核心电击参数及其影响

1. 电压（V）

• 是决定穿孔成功的关键因素。

• 不同细胞类型耐受电压不同，细胞体积越大，所需电压越低。

电压应根据电击杯间隙比例调整，以维持适当电场强度。

2. 电场强度（kV/cm）

是反映电压与电击杯间隙关系的核心指标。

一般细菌使用 10–12.5 kV/cm 的电场强度，酵母为 6–8 kV/cm，哺乳动物细胞为 1–3 kV/cm。

3. 电击杯间隙

常见规格包括 0.1 cm、0.2 cm 和 0.4 cm 三种。

• 0.1 cm 适用于高电场的小体积细胞（如细菌）；

• 0.2 cm 常用于酵母与部分真核细胞；

• 0.4 cm 适用于大型哺乳动物细胞或原生质体。

间隙过小会导致电场集中、放电不均；过大则能量分散，穿孔效率下降。

4. 电容（μF）

电容决定放电持续时间与波形衰减速度。
伯乐电穿孔仪 165-2660 的可调电容范围为 25–3275 μF。

• 低电容（25–125 μF）：释放快，适合短时间高压脉冲；

• 中等电容（200–500 μF）：能量释放均衡，常用于酵母与原生质体；

• 高电容（>1000 μF）：释放缓慢，适合哺乳动物细胞长脉冲模式。

电容越大，时间常数越长，细胞受热量也增加，因此需平衡导入效率与热损伤。

5. 电阻（Ω）

控制放电速度和波形平滑度。

• 低电阻：放电迅速，波形陡峭；

• 高电阻或无穷大（开路）：波形平缓。

伯乐电穿孔仪支持 50–1000 Ω 或 ∞ 模式，可根据样品电导率灵活设定。

6. 时间常数（τ）

在指数衰减波中，时间常数 τ 代表电压衰减至初始值 37% 所需的时间。
τ 与电容、电阻成正比：

τ=R×Cτ = R × Cτ=R×C

典型范围为 4–7 ms（细菌）、6–9 ms（酵母）或 2–5 ms（哺乳动物细胞）。
时间常数过短穿孔不充分，过长则细胞受热损伤。

7. 脉冲时间与次数

在方波模式下，伯乐电穿孔仪可设置单次脉冲时间（0.05–10 ms）及脉冲次数（1–10 次）。

多脉冲模式常用于哺乳动物细胞，能在温和条件下多次刺激膜通透性，提高导入率。
然而脉冲间隔过短可能导致膜修复不完全，增加死亡率。

8. 波形类型

165-2660 支持两种主要波形：

• 指数衰减波（Exponential Decay）：放电迅速，电压逐步衰减，适用于细菌与酵母。

• 方波（Square Wave）：电压恒定，能量分布均匀，适用于真核细胞。

波形选择与细胞类型密切相关，是实验设计的重要决策点。

五、电击条件与样品因素的关系

1. 缓冲液导电性

缓冲液的离子强度直接影响样品电阻与能量释放速度。

• 高盐缓冲液易造成电弧；

• 低盐或专用电穿孔缓冲液可有效减少热效应。

常用缓冲液包括：

• 细菌：1 mM HEPES 或纯水；

• 酵母：1 M 山梨醇 + 1 mM CaCl₂；

• 哺乳动物细胞：无离子 PBS 或 Opti-MEM。

2. 样品体积

一般建议样品体积为电击杯总容量的 80%，防止气泡形成。
体积过小会增加局部电流密度，容易产生电弧。

3. 细胞浓度

细胞密度影响电场分布与导入效率。

• 原核细胞：1×10⁹ cells/mL；

• 酵母：1×10⁸ cells/mL；

• 哺乳动物细胞：1×10⁶–1×10⁷ cells/mL。

过高密度会导致细胞聚集、局部过热，过低则信号弱、效率低。

六、不同细胞类型的推荐电击条件

1. 大肠杆菌

2. 酵母细胞

3. 植物原生质体

4. 哺乳动物细胞（CHO、HEK293）

七、电击条件优化策略

1. 电压梯度法

逐步增加电压，每次提升 100–200 V，观察导入率与存活率变化。找到最佳平衡点。

2. 时间常数调整

若时间常数太短，延长电容或提高电阻；若时间过长，降低电容或增大放电速率。

3. 预冷操作

在 4 ℃ 下操作可减轻电击热效应，提高细胞存活率。

4. 缓冲液离子调节

适当调整缓冲液离子浓度（如添加少量甘油）可改善电导性。

5. 多脉冲法

对真核细胞使用多脉冲方波模式，可在低电压下实现高导入效率。

6. 参数耦合优化

同时调整电压、电容和波形，通过设计实验矩阵（DOE 方法）获得最优组合。

八、电击后恢复与再生条件

电击后的细胞应立即转移至恢复培养基中，以促进膜修复与基因表达。

恢复期的温度与时间对细胞活性和导入分子稳定性有显著影响，应严格控制。

九、电击条件的常见问题与排查

十、电击条件与结果验证

165-2660 仪器可实时显示放电结果：

• 电压输出值

• 时间常数 τ

• 能量释放百分比

• 样品电阻

这些数据可作为验证实验条件是否达标的重要参考。
建议记录每次实验数据，建立参数数据库，用于后续分析与优化。

十一、安全注意事项

1. 操作前确保 ShockPod 盖锁闭合。

2. 使用低导电性缓冲液，防止电弧。

3. 放电结束后等待 “COMPLETE” 提示再取出电击杯。

4. 操作时避免接触金属部件与液体。

5. 定期清洁电极与电击槽，保持绝缘良好。