质保3年只换不修，厂家长沙实了个验仪器制造有限公司

一、概述

伯乐电穿孔仪 165-2661 是一款针对基因导入、蛋白质递送、RNA 转染与药物电穿孔等应用而设计的高精度仪器。
要获得高转化效率与良好细胞存活率，必须在操作前充分了解样品要求。样品条件直接影响电场分布、电导特性及膜孔形成，因此样品准备的规范化是确保实验成功的关键。

本指南全面介绍不同类型样品（细菌、酵母、动物细胞、植物原生质体及特殊体系）在电穿孔前的准备标准，帮助研究者科学设定实验条件。

二、样品基本要求

1. 纯净度要求

• 样品中不得含有任何盐离子、培养基残留或高导电杂质。

• 若使用含盐溶液（如 PBS、LB、DMEM 等），会在放电瞬间产生电弧，导致样品炭化或细胞死亡。

• 推荐使用低离子缓冲液或无离子水系统溶液，如 1 mM HEPES 或 无离子 Tris。

2. 电导率要求

理想电导率：0.5–1.5 mS/cm。

• 电导率过高 → 电弧风险增加、时间常数下降；

• 电导率过低 → 电场分布不均，能量释放不充分。

可使用电导仪检测样品电导率并调整缓冲液比例。

3. 悬液均匀性

样品必须为单细胞悬液。聚集或沉降会造成局部电场过强。

• 建议使用轻柔吹打或短时间低速离心重悬；

• 不可剧烈震荡，以免造成细胞膜破裂。

4. 温度要求

所有样品在放电前需预冷至 4℃。
低温可：

• 降低热积累；

• 提高细胞膜修复能力；

• 稳定电阻与时间常数。

放电后立即转入预温 37℃ 培养基恢复细胞状态。

5. 体积与浓度

电击杯中加入样品体积不超过总容积 80%。

• 0.1 cm 杯：40–50 μL；

• 0.2 cm 杯：60–80 μL；

• 0.4 cm 杯：400–800 μL。

细胞浓度建议：

三、细胞样品制备要求

（一）细菌

1. 生理状态
应选取对数生长期细胞（ OD₆₀₀ ≈ 0.5–0.7 ），此时期膜结构最具可逆性。

2. 洗涤步骤

• 取培养液 10 mL， 4℃ 离心 4000 rpm × 5 min；

• 弃上清，用 无离子 水或 10% 甘油洗涤 3 次；

• 最终重悬于 1 mM HEPES 或 10% 甘油中。

3. DNA 加入量
推荐 1–10 ng 高纯度质粒；过量 DNA 可能影响电场均匀。

4. 典型电压区间
1800–2500 V （0.2 cm 电极间隙）。

（二）酵母

1. 细胞培养
取对数期 Saccharomyces cerevisiae 培养物（ OD₆₀₀ ≈ 1.0 ）。

2. 预处理

• 洗涤 3 次 → 去除培养基盐分；

• 重悬于 1 M 山梨醇 缓冲液（维持渗透压）；

• 冰上静置 10 min。

3. DNA 添加量
100–500 ng 高纯度质粒 DNA。

4. 推荐条件
电压 1400–1600 V，电场 6–8 kV/cm，时间常数 6–8 ms。

（三）哺乳动物细胞

1. 细胞状态
细胞应处于 80% 融合或悬浮生长对数期，避免凋亡或高密度状态。

2. 培养条件

• 使用无血清培养液或 Opti-MEM 稀释；

• 不可含 NaCl > 20 mM；

• 细胞经 PBS 两次洗涤后重悬于低导缓冲液。

3. DNA/RNA 或蛋白质添加
每 0.4 mL 样品加入 1–2 μg 质粒或 mRNA。

4. 推荐电压
400–700 V （0.4 cm 间距，方波模式），时间常数 6–8 ms。

5. 复苏要求
电击后立即转入 37℃ 含血清培养基恢复 1–2 小时。

（四）植物原生质体

1. 原生质体提取
从新鲜叶片中经酶解获得单细胞悬液。

2. 洗涤
用 0.4 M 甘露醇溶液洗涤 2 次以维持渗透平衡。

3. DNA 用量
5–10 μg 纯化质粒 DNA。

4. 推荐条件
电压 600–800 V，电场 1.5–2 kV/cm，方波模式，时间常数 8–9 ms。

5. 特别注意
原生质体对剪切力极敏感，操作需轻柔，禁止震荡。

（五）特殊样品体系

1. 藻类与真菌孢子

• 电场强度 4–7 kV/cm；

• 需预冷 + 甘油保护；

• DNA 浓度 50–200 ng/样。

2. 纳米颗粒与药物递送体系

• 溶剂必须无离子且 pH 7.0 ± 0.2；

• 颗粒均匀分散，避免团聚；

• 体积 ≤ 0.5 mL。

3. 临床细胞样品

如 T 细胞、NK 细胞等免疫体系：

• 使用专用电穿孔缓冲液（低钠、无血清）；

• 电压 200–400 V，多脉冲模式。

四、缓冲液与化学环境要求

1. 推荐缓冲体系

2. pH 要求

维持在 6.8–7.4 之间。酸碱偏差会影响膜稳定性和离子迁移。

3. 温度与储存

所有缓冲液需 4℃ 保存，不得使用陈旧或受污染溶液。使用前恢复至室温以避免电导率突变。

五、外源分子要求

1. 质粒 DNA

• 纯度 ≥ 1.8 (A₂₆₀/A₂₈₀)；

• 无蛋白、无盐；

• 线性化或超螺旋形式均可。

2. RNA 或 mRNA

• 纯度 ≥ 2.0；

• 使用 DEPC 水溶解；

• 防止反复冻融。

3. 蛋白质

• 缓冲液离子强度低；

• 浓度 < 1 mg/mL；

• 避免含 Tris-HCl > 20 mM 或盐。

4. 纳米颗粒或药物

• 分散体系透明无沉淀；

• 颗粒直径 < 200 nm；

• 溶剂需无机盐 < 1 mM。

六、样品准备常见问题与排除

七、样品存放与运输

1. 短期保存：冰上保存 ≤ 1 小时；

2. 长期保存：离心后弃上清，细胞重悬于 10% 甘油，–80℃ 冻存；

3. 运输要求：使用干冰运输，避免温度波动。

DNA、RNA 等外源分子需独立低温保存，防止降解。

八、样品检测与预评估

在电穿孔前应进行以下检测：

1. 细胞活性检测：用 Trypan Blue 染色，活性 > 95% 方可使用。

2. 电导率检测：用便携式电导仪，确保在 0.5–1.5 mS/cm 之间。

3. 体积确认：注入电击杯前检查气泡并控制在安全容积。

4. 样品均匀性：显微镜下应无明显团块。

九、不同体系推荐样品标准

十、安全与规范

• 所有样品均应在 BSL-2 或等同条件下操作；

• 处理人体细胞或临床样品时需使用独立电击杯；

• 放电前确认盖锁闭合并佩戴绝缘手套；

• 实验台保持干燥、防止液体外溢；

• 废弃样品经高压灭菌后弃置。

十一、实验前检查清单

1. 样品无盐、无气泡；

2. 电导率检测合格；

3. 体积适配电击杯；

4. 外源分子纯度合格；

5. 电极与杯体干燥；

6. ShockPod 盖锁正常；

7. 参数设定匹配样品类型。

十二、样品准备优化建议

1. 减少盐离子残留：离心后用低离子缓冲液反复洗涤；

2. 提高膜稳定性：添加 甘油 5–10% 作为保护剂；

3. 提升导入率：保持对数期细胞活性；

4. 避免热积累：每次放电间隔 ≥ 10 秒；

5. 使用新鲜样品：避免冷冻反复融化造成膜损伤。

十三、样品要求对实验结果的影响

因此，样品质量控制是确保数据可重复性的基础。