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一、前言

伯乐（Bio-Rad）电穿孔仪165-2661是高精度电转化仪器，广泛应用于基因工程、分子生物学、细胞转染及蛋白表达研究。
该设备通过高压脉冲电场作用于细胞，使细胞膜形成瞬时可逆性孔洞，从而使外源DNA、RNA或蛋白质分子进入细胞内部。

正确掌握165-2661的操作要点，是确保实验成功、提高转化效率并延长设备使用寿命的关键。
本篇文档系统阐述伯乐165-2661在操作过程中的核心要点、注意事项、参数调整、常见问题及安全规范，为科研人员提供一份详尽的技术参考。

二、设备操作原理概述

电穿孔技术的核心在于瞬时能量释放，使细胞膜电势升高并突破膜电阻形成孔洞。
165-2661通过内置高压电源和多档电容控制电场强度与作用时间，达到精准控制穿孔效果的目的。

基本工作原理包括以下过程：

1. 充电阶段：系统为电容充电至设定电压；

2. 放电阶段：按下放电键后，能量通过电极释放至样品；

3. 电场作用：细胞膜发生电击孔化；

4. 恢复阶段：膜孔关闭，外源分子被细胞吸收。

能量释放过程符合指数衰减模型：

Vt=V0e−t/RCV_t = V_0 e^{-t/RC}Vt=V0e−t/RC

其中，V₀为初始电压，R为样品电阻，C为电容。时间常数τ=RC决定放电持续时间，是实验优化的关键参数。

三、操作前准备要点

1. 实验环境要求

• 室温保持在20–25°C，湿度≤60%；

• 实验台应干燥、平稳、无金属导电物；

• 设备周围应留有30 cm散热空间；

• 避免强磁场、电源波动及静电干扰。

2. 电源与接地检查

• 使用AC 220V ±10%，50/60 Hz电源；

• 确认接地良好，接地电阻≤1 Ω；

• 禁止与加热器或离心机共用插座。

3. 仪器外观与功能自检

开启电源后，设备会自动执行系统检测，确认以下项目：

• 电压模块正常；

• 电容充放电状态良好；

• 安全盖感应系统工作正常；

• 显示屏显示“Ready to Pulse”代表设备可用。

若显示错误代码（如“ARC ERROR”或“GND ERROR”），应停止使用并排查问题。

四、样品准备要点

1. 细胞状态

• 使用对数生长期细胞；

• 细胞浓度一般为10⁹ cells/mL（细菌）或10⁷ cells/mL（哺乳细胞）；

• 细胞应活力良好，无污染或死亡现象。

2. 缓冲液选择

• 电导率需控制在5–10 µS/cm；

• 推荐使用10%甘油、HEPES缓冲液或低离子溶液；

• 禁止使用含NaCl、PBS或培养基等高盐体系。

3. DNA或RNA样品

• DNA纯度（A260/A280）应在1.8–2.0之间；

• 质粒浓度建议为20–50 ng/µL；

• 混合均匀后置冰上待用。

4. 电转杯准备

• 选用0.1、0.2或0.4 cm间隙的电转杯；

• 使用前用70%乙醇清洗并自然晾干；

• 样品体积占电转杯容积的80%，避免气泡产生；

• 操作全程在冰上进行。

五、电击参数设置要点

1. 电压设定

通过按键“VOLTAGE”设定，范围0.2–2.5 kV，步进精度0.01 kV。
建议电压设定依据实验体系如下：

2. 电容设定

通过“CAP”键选择电容档位，范围25–3300 µF。
不同体系推荐如下：

3. 模式选择

按“MODE”键选择放电模式：

• SINGLE PULSE：适用于细菌、酵母；

• MULTI PULSE：适用于哺乳动物细胞；

• PROGRAM MODE：调用已保存参数方案。

4. 参数确认

按“ENTER”键确认设置，LCD显示：

vbnet复制编辑VOLTAGE: 2.50kVCAP: 25µF
READY TO PULSE

此时系统准备完毕，可进行放电操作。

六、电击操作要点

1. 将装有样品的电转杯置入电极槽；

2. 关闭安全盖，确保盖体磁感应系统锁定；

3. 按下“PULSE”键，系统充电并自动放电；

4. 放电后屏幕显示时间常数（τ）和状态；

5. 若显示“ARC DETECTED”，需重新制备样品；

6. 待屏幕恢复“READY”状态后方可进行下一次放电。

典型放电显示示例：

vbnet复制编辑VOLTAGE: 2.50kV
TIME CONST: 4.9msARC: NONE
COMPLETE

此时说明放电顺利完成。

七、放电后样品处理要点

1. 放电完成后，立即取出电转杯并置于冰上；

2. 用无菌移液器吸取样品，转入1 mL冰冷SOC或培养基中；

3. 复苏时间一般为45–60分钟（37°C，200 rpm摇床）；

4. 随后进行平板涂布或细胞培养。

复苏时间过短可能影响外源DNA整合，过长则增加代谢负担。

八、实验结果评估要点

1. 时间常数分析

放电后记录τ值（时间常数），应接近预设值。
若偏差>±0.3 ms，说明样品导电性异常或电极接触不良。

2. 电弧检测结果

若显示“ARC DETECTED”，应：

• 检查样品是否含盐；

• 检查是否存在气泡；

• 清洁电极并重新预冷。

3. 转化效率评估

根据菌落计数或荧光检测计算转化效率。
例如：

E=NC×DE = \frac{N}{C × D}E=C×DN

其中E为转化效率（CFU/µg DNA），N为克隆数，C为DNA用量，D为稀释倍数。

高效电击条件下，E. coli 转化效率可达 3×10⁶ CFU/µg DNA。

九、安全操作要点

1. 严禁在设备通电状态下触碰电极或样品；

2. 操作时需佩戴绝缘手套；

3. 若出现异常声响或气味，应立即切断电源；

4. 每次实验结束后，等待5秒再取出电转杯；

5. 放电后务必执行自动放电功能，以释放残余能量。

设备安全系统包括：

• 盖体联锁防护；

• 自动放电电路；

• 电弧检测保护；

• 接地电阻监控系统。

十、维护与清洁要点

1. 日常维护

• 每次使用后，用无水乙醇清洁电极槽；

• 检查电极无氧化或腐蚀；

• 定期检查电源线和插头是否牢固。

2. 月度维护

• 测试电压输出精度（允许偏差±1%）；

• 清洁风扇与通风口，保持散热通畅；

• 校验时间常数显示精度。

3. 年度校准

• 使用高压表检测输出电压；

• 测试电容实际容量并记录衰减率；

• 校准后由技术人员贴上合格标识。

十一、常见问题与应对要点

十二、实验优化与精确控制要点

1. 优化能量匹配
   调整电压与电容组合，确保时间常数在目标范围。

2. 保持低离子环境
   缓冲液纯度直接影响电场稳定性。

3. 严格温控管理
   样品温度过高会加速细胞破裂，应始终保持在4°C。

4. 记录与追踪
   每次实验记录电压、时间常数、ARC状态和转化效率，建立设备运行档案。

十三、数据记录与导出要点

伯乐165-2661具备数据存储与导出功能，可自动保存1000组实验数据。

数据内容包括：

• 放电日期与时间；

• 设定电压与电容；

• 实际τ值与电弧状态；

• 操作者编号。

通过USB导出后可生成CSV文件，用于统计分析或参数追踪。

十四、结果重复性与性能验证

根据连续实验数据统计：

• 时间常数偏差≤±0.2 ms；

• 电压输出误差≤±1%；

• 放电重复性误差CV≤2%；

• 转化效率波动范围≤10%。

说明在标准化操作条件下，165-2661具有高度稳定性与可重复性。

十五、总结与操作关键点汇总