伯乐电穿孔仪165-2660实验步骤

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一、前言

伯乐（Bio-Rad）电穿孔仪165-2660是一款广泛应用于分子生物学、基因工程及细胞转染实验的高性能设备。其核心原理是利用瞬时高压脉冲在细胞膜上形成可逆性孔道，使外源DNA、RNA或蛋白质进入细胞内部，实现基因导入或分子转化。

设备以高稳定性、高重复性和多功能控制著称，适用于细菌、酵母、哺乳动物细胞、植物原生质体及其他真核体系。为了确保实验的成功率与数据的可重复性，严格遵循标准化的操作流程尤为重要。本文将系统介绍165-2660电穿孔仪的实验步骤，从设备准备到实验后处理，全面阐述每个环节的关键细节与操作要点。

二、实验前准备

1. 仪器检查

在每次实验前，应对电穿孔仪进行全面检查，确保设备处于最佳工作状态：

检查电源是否稳定（建议220V ±10%）；
确认仪器显示屏正常、按键灵敏；
确保电极槽清洁无盐分或残留液体；
检查电转杯与接触点是否完好无裂痕；
打开电源后，观察自检提示是否正常显示“Ready”。

若发现任何异常（如“Check Cuvette”“Arc Detected”等提示），应暂停实验并重新确认连接状态。

2. 实验环境与安全条件

实验应在洁净、干燥、无电磁干扰的环境下进行；
操作者需佩戴防护手套与护目镜；
禁止在设备带电状态下更换电转杯；
仪器使用后应自动放电30秒后再进行维护。

3. 样品准备

电穿孔的核心是细胞样品的质量。不同细胞类型对电压与环境条件的要求不同。通用准备原则如下：

细菌样品：培养至对数生长期（OD600≈0.6），用10%甘油洗涤3次，保持低导电性。
酵母样品：提前进行酶解或渗透缓冲液预处理，去除细胞壁部分成分。
哺乳细胞：保持高活性、无钙镁离子环境，悬浮于等渗无盐缓冲液。
植物原生质体：确保酶解完全，悬浮于含0.5 M甘露醇缓冲液中以维持渗透压。

样品温度应保持在4°C左右，避免过热导致膜损伤。

4. 外源DNA或RNA样品准备

核酸纯度：A260/A280比值1.8–2.0；
浓度：10–100 ng/µL；
溶剂：无盐Tris或超纯水；
无任何乙醇、盐或酚残留。

三、仪器参数设置

1. 电压设定

根据细胞类型选择合适电压范围：

样品类型	推荐电压范围	电转杯间隙	电场强度(kV/cm)
大肠杆菌	2.3–2.5 kV	0.2 cm	11–12.5
酵母	1.0–1.5 kV	0.2 cm	5–7.5
哺乳动物细胞	0.25–0.8 kV	0.4 cm	0.6–2
植物原生质体	0.6–1.0 kV	0.4 cm	1.5–2.5

在设备前面板上旋转电压调节旋钮或通过数字输入键设定所需值。

2. 电容与时间常数

165-2660配备多档电容系统（25 µF–3300 µF），实验者可依据所需能量选择合适电容。电容越高，脉冲持续时间越长。
时间常数τ = R × C，一般理想值如下：

细菌：4–5 ms；
酵母：6–8 ms；
哺乳细胞：8–10 ms；
植物原生质体：10–12 ms。

设定完成后，按下“Ready”键确认系统进入待机状态。

3. 脉冲次数与间隔

165-2660可输出单脉冲或多脉冲信号。

单脉冲：用于细菌与酵母；
多脉冲：用于真核细胞转染。
间隔可设定为50–500 ms，建议默认100 ms以防热积累。

四、实验操作步骤

步骤1：样品混合

取50–100 µL细胞悬液于无菌离心管中，加入1–5 µL高纯DNA溶液。轻轻吹打混匀，不可剧烈震荡。
混合液保持在冰上备用，以减少电转前温升。

步骤2：电转杯准备

选择合适间隙的电转杯（0.1、0.2或0.4 cm），确保干燥洁净。

若杯体刚清洗完，应完全晾干；
用移液器吸取混合样品注入电转杯中，液体应覆盖电极并无气泡；
若出现气泡，可轻敲杯壁排除。

步骤3：放置与连接

将电转杯放入仪器电极槽内，确保接触紧密。
合上安全盖后，显示屏应自动提示“Ready”。此时系统进入待命状态。

步骤4：放电操作

按下“Pulse”或“Start”键，仪器输出瞬时高压脉冲。整个放电过程仅持续数毫秒。
结束后屏幕会显示：

实际电压（kV）；
放电时间常数（ms）；
脉冲曲线状态。

若出现“ARC DETECTED”提示，说明发生电弧，应检查缓冲液盐分或样品气泡。

步骤5：复苏与转移

放电完成后，立即用无菌移液器吸出样品，转入预先准备的复苏培养基中。
复苏条件：

细菌：37°C摇床复苏45–60分钟；
酵母：30°C静置复苏1小时；
哺乳细胞：37°C培养2–4小时后更换新鲜培养基；
植物原生质体：在等渗液中静置12小时以上恢复。

五、实验后处理

1. 样品培养与筛选

复苏后的细胞根据实验目的进行培养或筛选：

对转化质粒的样品，可在含抗生素平板上涂布；
对转染细胞，可进行荧光检测或抗性筛选；
对植物样品，可观察再生能力及转化率。

2. 数据记录

记录实验参数：电压、电容、脉冲次数、时间常数、样品体积、温度等。
165-2660可自动保存最近1000次放电数据，便于结果追踪与参数优化。

3. 电极与杯体清洁

实验结束后，断开电源并等待自动放电结束。
使用无离子水冲洗电转杯与电极槽，必要时可用70%乙醇消毒。
彻底晾干后保存，防止残留离子腐蚀。

六、实验优化与注意事项

1. 电压与电容匹配

电压过低会导致穿孔不足，转化率低；电压过高则细胞死亡率高。应在初次实验时使用较低电压起始，逐步增加以确定最佳条件。
一般电压与电容匹配规则：

细菌：2.5 kV / 25 µF；
酵母：1.5 kV / 50 µF；
哺乳细胞：0.45 kV / 250 µF；
植物原生质体：0.8 kV / 1000 µF。

2. 气泡与电弧防范

任何气泡都会形成局部高电阻，导致电弧放电。

操作时应缓慢注液；
电转杯应预冷；
样品导电性控制在理想范围（4–6 µS/cm）。

3. 温度控制

高温会加速细胞膜破裂。所有样品及杯体应预冷至4°C，放电后立即进行复苏。

4. 样品复苏时间

复苏时间不足会导致细胞膜修复不完全。对于不同体系应根据膜修复特性合理延长。

七、常见问题与解决办法

问题	可能原因	解决方案
出现电弧放电	缓冲液导电性高或样品中有气泡	重新洗涤样品，排气泡，更换缓冲液
时间常数异常低	样品电阻过小或电容设置错误	检查缓冲液成分，调整电容
转化效率低	电压过低、DNA浓度不足	提高电压或DNA浓度
样品过热	连续放电间隔过短	延长间隔或降低电容
无放电反应	电转杯未接触良好	重新插入电转杯或清洁电极