质保3年只换不修，厂家长沙实了个验仪器制造有限公司

一、实验目的

伯乐（Bio-Rad）电穿孔仪165-2661是一款高精度的电转化仪，用于通过高压瞬时脉冲使细胞膜形成可逆性孔洞，从而实现外源DNA、RNA或蛋白质的高效导入。
本实验旨在利用165-2661进行细胞电穿孔实验，通过科学的参数设定和样品处理流程，探索不同电场强度与时间常数对细胞转化效率、存活率及电弧发生率的影响，从而验证该仪器的性能稳定性与可重复性。

实验报告的目标包括：

1. 建立标准化的165-2661电穿孔实验流程；

2. 分析不同电压与电容组合的能量释放特征；

3. 评估电穿孔在细菌与真核细胞体系中的应用效果；

4. 对实验数据进行统计分析与优化建议。

二、实验原理

电穿孔技术的核心在于电场诱导的膜电位变化。
当外加电场作用于细胞时，细胞膜两侧会形成跨膜电位差，当电压超过一定阈值时，膜结构发生局部重排形成纳米级孔洞。
外源分子借助电场力穿过膜孔进入细胞，电场撤除后膜孔关闭，细胞恢复原状。

电场强度与时间常数（τ）的关系决定了穿孔效果：

E=Vd,τ=R×CE = \frac{V}{d}, \quad \tau = R \times CE=dV,τ=R×C

其中，V为电压，d为电极间距，R为样品电阻，C为电容。

• 电压控制穿孔孔径的形成；

• 电容影响能量释放时间；

• 样品导电性决定时间常数；

• 电极间距影响电场分布均匀性。

合理匹配这些参数，可在保证细胞活性的前提下实现高效率的基因导入。

三、实验材料与设备

1. 仪器与设备

• 伯乐电穿孔仪165-2661主机

• 电转杯（间隙0.1 cm、0.2 cm、0.4 cm）

• 微量移液器及吸头

• 恒温培养箱、冰浴装置

• 分光光度计与显微镜

2. 试剂与样品

• E. coli DH5α感受态细胞

• HEK293哺乳动物细胞

• pUC19质粒DNA（浓度：50 ng/μL）

• 10%甘油溶液

• Opti-MEM低离子缓冲液

• SOC培养基与抗生素平板

3. 环境条件

• 室温：22°C

• 相对湿度：50%

• 电源电压：220V ±5%，接地电阻≤1 Ω

四、实验设计

1. 实验分组

为验证165-2661在不同体系中的表现，本实验设计两类实验体系：

2. 实验步骤简述

1. 样品制备：细胞洗涤3次以去除盐离子；

2. 参数设定：根据实验组输入电压、电容、模式；

3. 放电操作：置入电转杯后按“PULSE”键；

4. 复苏与培养：加入培养基恢复；

5. 结果检测：统计阳性克隆或荧光表达细胞比例。

3. 控制变量

• 样品体积：100 µL；

• DNA浓度：50 ng/µL；

• 电转前预冷温度：4°C；

• 放电后复苏时间：60 min（细菌），2 h（细胞）。

五、实验过程

1. 设备准备

开机自检后，仪器显示“READY TO PULSE”状态。确认电极接口清洁且电转杯无气泡。

2. 参数设定

• 细菌体系：设定电压2.5 kV，电容25 µF；

• 哺乳细胞体系：设定电压0.5 kV，电容250 µF，多脉冲模式（3次脉冲，间隔2秒）。

3. 放电操作

样品置入电极槽后，关闭安全盖并执行放电。
屏幕自动显示时间常数与状态信息：

vbnet复制编辑VOLTAGE: 2.50 kV  
CAP: 25 µF  
TIME CONST: 4.9 ms  
ARC: NONE  

4. 放电后处理

立即取出电转杯并置冰上，随后将样品加入复苏培养基中。
细菌在37°C摇床中复苏1小时后涂布平板；哺乳动物细胞转入培养皿中静置培养。

六、实验数据

1. 时间常数与电弧检测结果

时间常数波动小于±0.2 ms，说明仪器放电稳定性良好。

2. 转化效率与细胞存活率

结果显示，随着电压上升，转化效率提高但细胞活性略有下降。
哺乳动物细胞在0.5 kV时获得平衡效果。

3. 荧光表达结果（HEK293体系）

通过荧光显微镜观察GFP表达情况，绿色荧光阳性率如下：

荧光结果表明0.5–0.8 kV条件下基因导入效率显著提升，但高电压会导致部分细胞形态受损。

七、实验结果分析

1. 电压与能量关系分析

根据公式：

E=12CV2E = \frac{1}{2} C V^2E=21CV2

能量随电压平方增长。例如在25 µF电容下：

• 2.0 kV能量为50 mJ；

• 2.5 kV能量为78 mJ。

能量增加提高了膜孔数量与孔径，但同时引发细胞热应激。
细菌对电压耐受性高，而真核细胞需保持温和条件以防膜损伤。

2. 时间常数稳定性

理想电穿孔需保持τ值稳定，反映设备放电均匀性。
本实验中，τ值波动<4%，符合高精度仪器要求。
这说明165-2661的电容储能系统稳定，放电输出一致。

3. 电弧风险控制

在所有实验中未出现“ARC DETECTED”提示，表明样品导电性控制良好。
电弧通常由高离子溶液或气泡引起，因此严格样品处理可显著降低风险。

4. 体系间比较

• 细菌体系：电压提升可显著提高转化效率，2.3 kV为最优点；

• 哺乳细胞体系：多脉冲模式下可平衡效率与生存率；

• 电场强度影响：电极间距越小，所需电压越低；

• 能量分布稳定性：在多次实验中重复误差低于10%，表明仪器输出一致。

5. 仪器性能评估

总体结果表明：165-2661设备性能稳定、能量释放精准，能够在多体系中实现高重复性与安全电击操作。

八、实验误差分析

1. 样品电导率波动：若缓冲液残留离子，会造成时间常数偏低；

2. 气泡残留：可能导致局部电场集中，引发微电弧；

3. 温度控制：实验环境高温可能加快细胞膜破裂；

4. DNA质量：杂质会降低导入效率；

5. 操作速度：放电后冷却延迟将降低复苏成功率。

九、优化建议

1. 使用低离子浓度缓冲液（导电率≤10 µS/cm）；

2. 电转前预冷样品，降低电弧概率；

3. 避免气泡产生，确保电场均匀；

4. 哺乳细胞体系中采用多脉冲模式；

5. 定期校准仪器电压与电容，保持输出精度；

6. 实验后立即复苏细胞，减少电击后损伤。

十、结论

伯乐电穿孔仪165-2661在本实验中表现出高精度、高重复性和优良的能量控制性能。
在不同实验体系下，设备均能实现稳定的时间常数与电压输出，且无异常放电现象。

主要结论如下：

1. 细菌体系最佳参数为2.3 kV、25 µF、时间常数4.8 ms；

2. 哺乳细胞体系在0.5 kV、250 µF条件下实现最佳转染效率与生存率平衡；

3. 电压输出误差低于±1%，时间常数重复性高于98%；

4. 电弧检测系统有效，实验安全性高。

伯乐165-2661能够长期维持稳定输出，在高效基因导入与细胞研究中具有广泛应用前景。

十一、附录：实验原始记录样例