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一、设备与样品概述

伯乐（Bio-Rad）电穿孔仪165-2660是一款高精度的电转化系统，广泛应用于分子生物学、基因工程、细胞转染和基因编辑实验。该设备通过瞬时高压脉冲在细胞膜上形成可逆性微孔，使外源DNA、RNA或蛋白质进入细胞内部。
在整个实验体系中，样品的质量与处理方式是影响电穿孔效果的核心要素之一。即使仪器性能再优异，若样品不符合电转化要求，也会导致低转化效率或细胞死亡率升高。因此，在正式操作前，样品的准备与质量控制至关重要。

伯乐165-2660的设计允许在广泛的样品类型下使用，包括细菌、酵母、植物原生质体、哺乳动物细胞、干细胞以及原代组织细胞。不同类型样品的物理特性、导电性及生理状态差异较大，需依据各自特征制定相应的预处理方案。

二、样品的基本要求

1. 细胞活性要求

电穿孔实验要求细胞处于高活性、对数生长期或生理稳定状态。

• 对于细菌和酵母，需确保处于指数生长期，OD600值一般在0.5–0.8之间；

• 对于真核细胞，应选择处于生长旺盛、贴壁良好、形态均一的群体；

• 原代细胞或干细胞实验需避免细胞过度分化或凋亡。

细胞活性直接影响膜恢复能力与电穿孔后复苏效率。若样品活性下降，将导致电场作用下膜损伤不可逆，实验失败率增加。

2. 样品纯度要求

电穿孔过程中电流需通过样品液体形成稳定电场，因此样品纯度必须高。
污染的离子、蛋白、杂质会改变导电性并导致电弧放电。

• 所有细胞悬液应使用无离子缓冲液洗涤2–3次；

• DNA、RNA样品需纯度高、无蛋白或有机溶剂残留；

• 若使用商业提取试剂，应在最后步骤彻底去除盐分。

纯度不足的样品容易产生“电弧效应”，不仅损坏电极，也使细胞全部死亡。

3. 样品浓度要求

适当的细胞浓度有助于形成均匀的电场环境。浓度过高会造成电阻降低、放电不均；浓度过低则导致转化效率不足。
一般推荐浓度如下：

DNA或RNA加入量通常控制在样品体积的1–10%范围内，浓度建议为10–100 ng/µL。过高浓度会导致黏度增加、局部电场分布不均。

三、缓冲液及离子环境要求

1. 缓冲液导电性

电穿孔要求液体导电性低，以防止能量被离子消耗或引发电弧。伯乐建议使用专用的无离子电穿孔缓冲液。常用溶液包括：

• 无盐HEPES缓冲液；

• 无离子甘露醇缓冲液；

• 低离子含量PBS衍生液（需特别去除NaCl）。

导电性理想值应低于 5 µS/cm。若使用水或普通生理盐水，极易导致高电流和热损伤。

2. pH与渗透压

电穿孔过程中，细胞膜短暂暴露在高电场下，若溶液pH或渗透压异常，会加剧细胞应激。

• pH应维持在7.0–7.4范围；

• 渗透压需接近细胞内环境，尤其是原生质体与动物细胞，应添加等渗组分（如250 mM蔗糖或甘露醇）。

高渗或低渗环境均可能导致细胞形态异常，降低膜修复能力。

3. 缓冲液温度

低温有助于减少电穿孔过程中热效应。实验前所有缓冲液应预冷至 4°C 左右，但不得冻结。温度过低会增加液体电阻，而温度过高会导致膜不可逆破裂。

四、DNA与RNA样品要求

1. 纯度与浓度

核酸样品应具备较高纯度，A260/A280比值在1.8–2.0之间。任何盐离子、乙醇、酚或蛋白残留都会干扰放电波形。
若使用乙醇沉淀纯化的DNA，需彻底干燥残留乙醇后再溶于无盐缓冲液中。

浓度建议：

• 质粒DNA：10–100 ng/µL；

• 线性DNA：20–200 ng/µL；

• mRNA：0.1–1 µg/µL。

2. 分子大小

质粒或线性DNA分子越大，进入细胞所需电场强度越高。一般情况下，小质粒（<10 kb）电压1.5–2.0 kV即可，而大分子载体可能需略高电压或延长脉冲时间。
对于RNA类样品，应避免长时间暴露空气，实验全程保持无RNA酶环境。

3. 缓冲体系相容性

DNA或RNA应溶解于与细胞悬液成分相容的缓冲体系中，避免离子浓度差异导致局部电压集中。常用溶剂包括无盐Tris、TE（低离子型）或超纯水。

五、不同样品类型的具体要求

1. 细菌样品

• 应选用新鲜培养、无污染的菌株；

• 在冰浴条件下洗涤，使用低导电性溶液（10%甘油或无盐Tris）；

• 质粒加入量控制在样品体积的1–2%；

• 电转杯需充分预冷，避免局部过热。

若出现放电火花，说明样品盐分过高，应重新洗涤。

2. 酵母与真菌样品

酵母细胞壁较厚，需提前酶解或化学预处理以增强膜通透性。常用方法包括β-葡聚糖酶处理或短暂高温冲击。
电穿孔时建议使用含蔗糖或山梨醇的渗透缓冲液，保证细胞不因渗透压差破裂。
样品温度应保持在0–4°C，减少热应激。

3. 哺乳动物细胞

哺乳动物细胞对电场极为敏感，要求：

• 悬浮状态均一，无团聚；

• 缓冲液无钙镁离子，导电性低；

• 样品体积一般为50–100 µL；

• DNA质量高，避免载体内内毒素残留。

放电结束后，应立即转入含血清培养基中复苏，以促进膜修复。

4. 植物原生质体

植物原生质体需通过酶解法制备，确保细胞壁完全去除。

• 悬浮介质含0.5 M甘露醇或蔗糖，维持等渗；

• 电转样品应避免气泡形成；

• 电压0.6–1.0 kV，电容1000 µF，放电时间10 ms左右；

• 放电后立即在低温等渗液中静置数小时以恢复膜完整性。

5. 干细胞与免疫细胞

此类细胞结构脆弱，应严格控制电压与时间常数。
样品需新鲜分离，避免离心过度；
缓冲液可使用专用电穿孔缓冲体系，维持渗透压与细胞活性。
RNA或RNP导入实验中应全程无RNA酶操作，并在冰上快速进行。

六、样品体积与电转杯要求

1. 体积控制

电转杯体积决定电场分布。伯乐165-2660兼容多种电转杯规格，常用为0.1 cm、0.2 cm和0.4 cm间隙。

液体体积过多易产生电流不均，过少则易形成气泡导致电弧。液面应平整且无气泡，操作时可轻轻敲击杯壁排气。

2. 电极清洁与杯体状态

电极若附着盐分或蛋白，会增加局部电阻，产生放电异常。实验前应使用无离子水或70%乙醇清洗杯体，并自然晾干。
杯体表面需保持完好、无划痕，以防电流集中造成电弧。

七、样品温度与环境控制

温度直接影响液体电阻与细胞膜稳定性。

• 推荐操作温度为0–4°C；

• 样品应全程置于冰上，但不得冻结；

• 高温会加快膜破裂并降低存活率。

实验结束后，应立即将样品移入预温培养基中复苏，避免因温差导致细胞应激。

八、实验前准备与检测

1. 样品检测：
   在正式电穿孔前，可取少量样品检测电导率，理想值为4–6 µS/cm。若过高，应继续洗涤。

2. 气泡检查：
   样品装入电转杯后，仔细观察是否有气泡。气泡是导致放电失败的主要原因之一。

3. 浓度确认：
   若细胞过于密集，可适度稀释。对于高密度样品，需避免形成聚团。

4. 质粒测试：
   在大规模转化前，应以小样测试质粒质量与浓度，确定最优条件。

九、样品稳定性与存储

实验用样品应现制现用，不建议长时间储存。若确需保存：

• 细胞悬液可在4°C短期存放，不超过2小时；

• DNA、RNA样品可置于-20°C长期保存，但使用前需缓慢解冻并保持无菌环境；

• 电转杯不得重复使用污染样品，避免交叉反应。

十、常见问题与解决方案

十一、样品优化策略

伯乐165-2660具备高精度电压与电容控制系统，允许实验者针对不同样品进行细致优化。优化过程可分为以下步骤：

1. 从较低电压开始逐步提高，观察时间常数变化；

2. 调整细胞浓度与DNA比例；

3. 记录每次实验的温度、时间常数与复苏结果；

4. 通过统计分析确定最优条件。

建立样品数据库后，后续实验可快速调用参数，提高效率与重复性。