质保3年只换不修，厂家长沙实了个验仪器制造有限公司

一、概述

伯乐（Bio-Rad）电穿孔仪165-2661是一款集精确控制、高效能量释放与智能化管理于一体的高性能电转化设备，主要用于DNA、RNA或蛋白质在细胞内的导入实验。该仪器可产生受控高压脉冲，瞬间改变细胞膜的电势状态，形成可逆性纳米孔洞，从而实现分子跨膜运输。

165-2661型号在电压调节精度、电容释放稳定性、时间常数检测及安全防护方面均较前代产品有显著提升。其操作系统设计简洁，具备自动检测、数据记录、参数存储及错误报警功能，适用于细菌、酵母、哺乳动物细胞和植物原生质体等多种体系。

本教程旨在详细介绍伯乐165-2661的操作步骤、实验流程、参数设置、样品准备及注意事项，帮助科研人员掌握标准化实验操作流程，实现高效、安全、可重复的实验结果。

二、仪器组成与功能概述

165-2661电穿孔仪主要由以下部分构成：

1. 主机系统：控制电压、电容及时间常数的核心模块。

2. 高压储能与放电系统：用于能量积累与脉冲释放。

3. 电极输出接口：连接电转杯并传导能量。

4. 显示与控制面板：设置实验参数与实时显示状态。

5. 安全防护模块：包括电弧检测、安全盖感应与过压保护。

6. 散热系统：维持内部温度稳定。

仪器结构紧凑，参数调节采用数字化控制，所有关键数据均通过LCD屏实时显示，确保操作可视化与可追溯。

三、实验前准备

1. 环境要求

• 温度范围：20–25°C；

• 相对湿度：≤60%；

• 电源电压：AC 220 V ±10%；

• 接地电阻：≤1 Ω；

• 环境应无强磁场、导电尘埃及振动源。

2. 仪器检查

在开机前，操作人员应完成以下检查：

1. 确认电源线完好且接地可靠；

2. 检查电极接口及电转杯是否干燥、清洁；

3. 确认安全盖感应装置正常；

4. 检查面板是否显示“Ready”；

5. 确保电源插座不与其他高功率设备共用。

3. 样品准备

以大肠杆菌为例，样品制备过程如下：

1. 接种菌株于LB培养基中，37°C培养至OD₆₀₀≈0.4；

2. 离心（4000 rpm，5分钟），去上清；

3. 使用冰冷10%甘油溶液洗涤3次，去除培养基盐分；

4. 将菌体重悬于10%甘油中，浓度约1×10⁹ cells/mL；

5. 加入外源质粒DNA（1–2 µg）；

6. 冰上预冷5分钟备用。

对于哺乳动物细胞，可采用无血清缓冲液（如Opti-MEM）重悬，并保持低温操作。

四、开机与自检流程

1. 打开电源开关，仪器进入启动自检状态；

2. 系统检测高压模块、电容组、安全盖感应器及电极连接状态；

3. 若显示“Ready to Pulse”，表示可进入操作阶段；

4. 若出现“Check System”提示，应检查安全盖或电极接触是否异常。

自检通过后，系统自动进入主界面，显示默认电压、电容与时间常数值。

五、实验参数设置

1. 电压设置

按下“VOLTAGE”键，使用方向键输入所需电压。

• 电压范围：0.2–2.5 kV；

• 分辨率：0.01 kV；

• 建议设置：

• 细菌体系：2.0–2.5 kV；

• 酵母体系：1.0–1.5 kV；

• 哺乳细胞：0.25–0.8 kV；

• 植物原生质体：0.8–1.0 kV。

2. 电容设置

按下“CAP”键选择所需电容档位（25–3300 µF）。

• 小电容：用于细菌或短脉冲放电；

• 中等电容：用于真核细胞或中能量体系；

• 大电容：用于植物细胞或大体积电击实验。

3. 模式选择

• 单脉冲模式（Single Pulse）：适合细菌与酵母；

• 多脉冲模式（Multi Pulse）：适合哺乳动物细胞，增强DNA导入效率；

• 程序模式（Program Mode）：可调用已保存参数组。

4. 确认与保存

设定完成后，按“ENTER”键确认，屏幕显示设定参数；
如需保存当前方案，按“SAVE”，系统自动编号并记录。

六、样品加载与电转操作

1. 样品装入电转杯

1. 取预冷电转杯（0.2 cm间隙）置于冰上；

2. 吸取40–50 µL样品混合液加入电转杯；

3. 轻拍电转杯底部以排除气泡；

4. 将电转杯插入仪器电极槽中，确保接触良好；

5. 关闭安全盖。

2. 放电执行

1. 按下“PULSE”键启动放电；

2. 仪器自动释放储能电量并显示放电状态；

3. 屏幕实时显示：

• 实际电压值（V）；

• 时间常数τ（ms）；

• 电弧检测状态（OK或ARC）；

4. 放电完成后，系统发出提示音并显示“Pulse Complete”。

3. 放电时间与波形判断

• 正常放电：时间常数为4–8 ms，显示“OK”；

• 异常电弧：显示“ARC DETECTED”，需重新制备样品；

• 电流中断：可能因安全盖未闭合或电极接触不良，应重新检测。

七、放电后处理

1. 取出电转杯并立即置于冰上冷却2分钟；

2. 向电转杯中加入1 mL冰冷SOC复苏培养基；

3. 将混合液转移至无菌离心管中；

4. 37°C培养1小时以恢复细胞；

5. 涂布含抗性标记的培养基平板并培养12–16小时；

6. 观察转化菌落或进行后续筛选。

哺乳细胞体系需在无血清条件下复苏4小时后更换完全培养基。

八、操作注意事项

1. 防止电弧放电

• 样品中不得含盐；

• 电转杯内无气泡；

• 电极表面保持干燥。

2. 控制温度

• 所有样品与电转杯需预冷；

• 放电后立即冰浴处理。

3. 电压与电容匹配

• 电压过高或电容过大会导致细胞膜不可逆损伤；

• 建议通过小范围预实验优化。

4. 安全防护

• 放电过程中不得触碰仪器；

• 仪器必须可靠接地；

• 若设备出现异响或冒烟，应立即断电。

5. 多次实验间隔

• 每次放电间隔≥30秒，以防电容过热。

九、数据读取与记录

165-2661可实时记录实验数据，包括：

• 放电电压；

• 电容值；

• 时间常数；

• 电弧检测状态；

• 实际放电曲线。

操作步骤：

1. 按下“VIEW”键查看上一次放电记录；

2. 可通过USB接口导出数据文件（TXT或CSV格式）；

3. 建议建立实验记录表，包括样品编号、参数组合及结果分析。

标准记录示例：

十、清洁与维护

1. 实验结束后

1. 关闭电源，待风扇停止后拔出电源插头；

2. 用无水乙醇或去离子水清洁电极槽；

3. 擦干仪器表面，保持通风干燥；

4. 电转杯清洗后晾干备用。

2. 定期维护

十一、常见问题与解决方案

十二、实验优化建议

1. 细胞状态

• 细胞应处于生长对数期，过度培养会降低电穿孔效率。

2. DNA纯度

• 使用高纯度质粒DNA，A₂₆₀/A₂₈₀应在1.8–2.0之间。

3. 缓冲液导电性

• 理想导电率≤10 µS/cm，过高会导致电弧。

4. 能量调控

• 通过调节电压或电容微调能量密度，平衡转化效率与细胞存活率。

5. 重复性验证

• 同一参数下进行3次独立放电，若时间常数偏差<0.2 ms，则条件稳定。

十三、安全操作规范

1. 设备运行期间禁止打开安全盖或接触电极；

2. 若仪器报警，应立即停止操作并关闭电源；

3. 实验室应配备干粉灭火器、防电击绝缘垫与急救设施；

4. 操作人员须接受高压设备培训；

5. 定期进行安全检查与电气检测。

十四、结果评估

电穿孔成功的关键指标包括：

• 细胞存活率高于80%；

• 无电弧放电；

• 转化效率达到预期标准（如>10⁸ CFU/µg DNA）；

• 时间常数稳定在理论值±0.2 ms范围内。

若结果偏差明显，应重新评估缓冲液成分、电极清洁度及能量参数。