伯乐电穿孔仪165-2661操作步骤

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一、概述

伯乐（Bio-Rad）电穿孔仪165-2661是一款专业的高压脉冲电转化仪，专为基因导入、细胞电转染、质粒转化和蛋白质导入实验而设计。该设备通过瞬时高压脉冲在细胞膜上形成可逆性孔洞，使外源DNA、RNA或其他带电分子穿过细胞膜，从而实现高效导入。

165-2661作为伯乐电穿孔仪系列的改进型号，在电压精度、能量释放速度、放电稳定性以及电弧防护系统方面均有显著提升。其操作系统采用数字化控制面板，可自动计算时间常数（τ），并具备多组参数存储功能，便于用户快速调用常用实验设置。

本文将对165-2661的操作步骤、实验准备、放电执行流程、安全管理及数据记录方法进行系统阐述，以指导科研人员在操作中实现高重复性、高效率与安全性的统一。

二、操作前准备

1. 环境要求

实验室温度：20–25°C；
相对湿度：≤60%；
电源规格：AC 220 V ±10%，50/60 Hz；
接地电阻：≤1 Ω；
环境条件：无强磁场干扰、无高湿、无导电尘埃；
通风要求：仪器背部至少保持30 cm的散热间距。

2. 仪器检查

在开机前必须完成以下自检：

检查电源线是否完好并确认接地端连接正确；
检查电极接口、输出端无污渍与腐蚀；
确认安全盖感应系统灵敏；
清洁电转杯与支架，避免残留盐分或水分；
检查主机显示屏能正常亮起，键盘操作响应灵敏。

如设备自检失败或出现“Check System”提示，应停止使用并联系维护人员。

三、样品准备步骤

1. 细胞制备

根据实验对象不同，细胞制备方式略有差异。以下以常见的大肠杆菌和哺乳细胞为例：

细菌（如E. coli DH5α）

取单菌落接种于5 mL LB液体培养基中，37°C、220 rpm培养过夜；
将1 mL菌液接种入100 mL新鲜LB培养基中，培养至OD₆₀₀≈0.4；
离心收集菌体（4000 rpm，4°C，5分钟）；
使用冰冷10%甘油溶液洗涤3次，去除培养基盐分；
重悬于10%甘油溶液中，浓度约1×10⁹ cells/mL；
4°C保存，24小时内使用。

哺乳动物细胞（如CHO或HeLa）

使用胰蛋白酶消化贴壁细胞，收集并离心；
重悬于无血清缓冲液或电穿孔专用缓冲液中；
调整浓度至2×10⁶ cells/mL；
保持低温备用（4°C）。

2. 样品混合

将外源DNA或RNA溶液（通常为1–2 µg）加入感受态细胞中；
混合均匀后置于冰上预冷3–5分钟；
检查液体是否无气泡，避免放电时产生电弧。

3. 电转杯准备

选择合适间隙的电转杯（0.1、0.2或0.4 cm）；
使用无菌纯水清洗并风干；
放入冰上预冷10分钟后使用。

四、参数设定步骤

165-2661的数字化面板可实现高精度参数设定。以下为详细设置流程：

电压设定（Voltage）

按下“VOLTAGE”键进入电压设定界面；
使用方向键输入所需电压（范围0.2–2.5 kV）；
按“ENTER”确认。

电容设定（Capacitance）

按“CAP”键选择电容档位；
可调范围：25、50、125、250、500、1000、3300 µF；
系统自动切换储能单元并显示实际值。

电阻选择（Resistance）

默认固定电阻200 Ω；
特殊实验可启用外接电阻模块（选配）。

模式选择（Mode）

单脉冲模式：适合细菌、酵母等；
多脉冲模式：适合哺乳动物细胞；
程序模式：保存常用参数，快速调用。

安全检测确认

设备自动检测电极接触、电源接地及安全盖状态；
显示“Ready to Pulse”后方可进行实验。

五、电穿孔操作步骤

1. 样品装载

吸取40–50 µL细胞混合液加入电转杯；
确保液面均匀覆盖电极表面；
轻拍电转杯底部，排出微小气泡；
插入电击槽，确保电极完全接触。

2. 启动放电

关闭安全盖；
按下“PULSE”键；
系统瞬时释放储能电量并开始放电；
显示屏实时显示放电电压、时间常数（τ）及状态信息；
放电完成后屏幕显示“Pulse Complete”。

3. 放电时间与状态判断

正常放电：显示“OK”，时间常数为稳定衰减曲线（如4.8 ms）；
电弧放电：显示“ARC DETECTED”，表示样品导电性过高或存在气泡；
放电中断：显示“ABORTED”，通常由安全盖打开或接地异常引起。

如检测到异常，应立即停止操作，重新制备样品或检查电转杯。

六、放电后的处理步骤

样品冷却
放电后立即取出电转杯并置于冰上1–2分钟，防止热效应损伤细胞。
复苏与培养

向电转杯中加入1 mL冰冷SOC或无血清培养基；
轻轻混匀后转移至离心管；
在37°C下复苏60分钟（细菌）或在37°C、5% CO₂条件下复苏4小时（哺乳细胞）。

筛选培养

涂布含抗生素的平板（对细菌）；
接种入选择性培养基或转染培养体系（对真核细胞）；
培养12–24小时后观察结果。

七、实验数据记录

伯乐165-2661具备数据存储与导出功能。实验完成后应记录以下信息：

项目	参数值	备注
电压	2.5 kV	设定值
电容	25 µF	档位2
电极间隙	0.2 cm	标准杯
时间常数	4.8 ms	实测值
电弧状态	无	正常放电
样品温度	4°C	冰浴条件
转化效率	9.8×10⁸ CFU/µg DNA	实验结果

实验数据可通过USB接口导出至电脑进行存档与分析。

八、安全注意事项

高压防护

严禁在安全盖打开时放电；
操作时手部不得接触电极区域；
每次放电后等待5秒再取样，防止残余电荷。

样品安全

使用低导电缓冲液，避免电弧损坏；
禁止含盐PBS或NaCl溶液进入电转杯；
每次实验后清洗电极，防止盐沉积。

环境防护

保持实验台干燥，防止漏电；
远离磁性设备与热源；
放电时避免他人靠近。

异常处理
若设备报警或屏幕闪烁异常，应立即断电；
检查高压电缆连接与接地状态，确认无异常后再重新启动。

九、操作流程标准化建议

为确保重复性与安全性，建议建立以下标准操作规程（SOP）：

开机前检查表

电源与接地是否正常；
电极与电转杯是否干净；
温度与湿度是否达标。

参数记录模板
每次实验应完整记录电压、电容、时间常数、温度及电弧状态。
重复实验验证
同一条件下连续放电10次，若时间常数标准偏差<0.2 ms，则系统稳定。
月度维护

清洁电极接口；
检查风扇与散热系统；
验证电压输出精度（偏差≤1%）。

十、常见问题与解决措施

问题	原因分析	解决方案
电弧频繁	样品电导率过高或有气泡	使用低离子缓冲液并排气泡
时间常数偏低	电阻下降或电极污染	清洁电极并更换缓冲液
放电不启动	安全盖未关闭或接地异常	检查安全锁和电源线
样品加热严重	能量过大或复苏延迟	降低电压并立即冰浴
无菌落生长	DNA质量低或细胞损伤	优化DNA纯度并调整能量